(武漢大學(xué)人民醫(yī)院骨外科，湖北省武漢市 430060，電子郵箱：1032759008@qq.com)

骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis,OA)是一種常見的關(guān)節(jié)退行性疾病，其特點(diǎn)是軟骨損傷、骨贅形成、軟骨下骨硬化和關(guān)節(jié)周圍組織退變[1]，臨床上主要表現(xiàn)為關(guān)節(jié)腫痛、僵硬、活動(dòng)受限，嚴(yán)重者甚至殘疾。OA的病因主要有生物力學(xué)因素、年齡、肥胖、關(guān)節(jié)損傷等。隨著社會(huì)人口老齡化進(jìn)程的加速，OA的患病率逐年升高，已成為當(dāng)今嚴(yán)重的社會(huì)醫(yī)學(xué)問題之一。研究OA的病因、發(fā)病機(jī)制及防治方法具有極其重要的價(jià)值。OA病損不僅累及關(guān)節(jié)軟骨，還可累及整個(gè)滑膜關(guān)節(jié)器官，包括半月板，滑膜、韌帶、關(guān)節(jié)囊、軟骨下骨及肌肉[2-3]，其中滑膜還參與OA的軟骨退變過程[4]。在OA的早期階段即存在滑膜炎，而在OA的進(jìn)展過程中滑膜組織出現(xiàn)增生和肥大。研究表明成纖維樣滑膜細(xì)胞在OA的發(fā)病機(jī)制中起重要作用，其可以通過分泌炎性細(xì)胞因子[腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)，白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)]和基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)促進(jìn)滑膜炎和軟骨退變[5-6]。因此，通過體外分離培養(yǎng)獲得原代成纖維樣滑膜細(xì)胞，研究其在正常條件下的形態(tài)和功能對(duì)闡明OA的病因具有重要意義。本研究通過優(yōu)化體外分離培養(yǎng)方法獲得原代成纖維樣滑膜細(xì)胞，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 杜氏改良伊格爾培養(yǎng)基(Dulbecco′s modified Eagle medium，DMEM)/F12高糖培養(yǎng)基(美國塞默飛世爾科技有限公司，批號(hào)：WG)；胎牛血清(美國Gibco公司，批號(hào)：10100147)；青霉素/鏈霉素雙抗(武漢谷歌生物科技有限公司，批號(hào)：G4003)、Ⅱ型膠原酶(美國西格瑪奧德里奇公司，批號(hào)：G5026-1)；anti-CD90/Thy1免抗人抗體、波形蛋白(Abcam公司，批號(hào)：ab13350、ab45939)；山羊抗兔異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyante，F(xiàn)ITC)綴合的二抗和山羊抗兔CY3綴合的二抗(武漢賽維爾生物科技公司,批號(hào)：GB22303、GB21303)；0.25%胰蛋白酶(武漢科瑞公司，批號(hào)：GNM15400)；牛血清白蛋白(武漢賽維爾生物科技公司，批號(hào)：G5001)。完全培養(yǎng)液由DMEM/F12高糖培養(yǎng)基、胎牛血清、雙抗按100∶15∶1比例配制而成，于4℃環(huán)境下儲(chǔ)存?zhèn)溆?；Ⅱ型膠原酶工作液用100 mg Ⅱ型膠原酶溶解于100 ml DMEM/F12高糖培養(yǎng)基配制而成，于-20℃環(huán)境下儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要儀器 二氧化碳培養(yǎng)箱購自德國BINDER股份有限公司，超凈工作臺(tái)購自美國Airtech公司，超純水系統(tǒng)購自德國Merck Millipore公司，普通顯微鏡及倒置顯微鏡均購自O(shè)lympus公司，高壓滅菌鍋購自日本SANYO公司，低速離心機(jī)購自上海白楊公司(BY-160C型)，眼科鑷、眼科剪、10 cm玻璃培養(yǎng)皿、巴士吸管、離心管(15 ml、50 ml)、25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)皿購自美國康寧公司。

1.3 標(biāo)本來源 標(biāo)本來源于在我院骨外科行關(guān)節(jié)置換術(shù)的6例OA患者，診斷符合美國風(fēng)濕病學(xué)院制定的OA診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]。患者均簽署知情同意書，研究方案經(jīng)武漢大學(xué)人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。獲取的滑膜組織保存于無菌的生理鹽水中，置于冰盒運(yùn)送至我院中心實(shí)驗(yàn)室處理。

1.4 成纖維樣滑膜細(xì)胞的分離培養(yǎng) 在超凈工作臺(tái)上，將滑膜組織置于經(jīng)高壓滅菌的無菌玻璃皿中，使用無菌磷酸緩沖鹽(phosphate buffer saline,PBS)溶液漂洗數(shù)次后，用眼科剪和眼科鑷分離出滑膜組織周圍的脂肪，并用眼科剪將滑膜組織剪成1 mm3的碎塊，用無菌PBS溶液漂洗1次，再用無菌巴士吸管吸入15 ml離心管中以1 000 r/min離心10 min，去掉上清液，將剪碎的組織塊按照一定量分別放入25 cm2透氣培養(yǎng)瓶中，每瓶加入2 ml Ⅱ型膠原酶工作液，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱分別消化0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h后，將瓶?jī)?nèi)混合物分別轉(zhuǎn)移至5 ml離心管中，以1 000 r/min離心10 min，去掉上清液。用PBS溶液漂洗，將不同消化時(shí)間的細(xì)胞和組織塊沉淀，用2 ml完全培養(yǎng)液重懸(完全培養(yǎng)液過多細(xì)胞不易貼壁，因此培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)最多加2 ml培養(yǎng)基)，轉(zhuǎn)移至25 cm2透氣培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，倒置顯微鏡觀察到細(xì)胞貼壁后，用無菌PBS溶液洗去懸浮的死細(xì)胞和組織塊，更換培養(yǎng)液。

1.5 成纖維樣滑膜細(xì)胞傳代 在倒置顯微鏡下觀察到有80%的成纖維樣滑膜細(xì)胞融合時(shí)，棄掉完全培養(yǎng)液，加入無菌PBS溶液沖洗2～3次，加入1 ml胰蛋白酶消化，用2 ml完全培養(yǎng)液終止消化后，移至5 ml的無菌EP管中，1 000 r/min離心5 min后，棄掉完全培養(yǎng)液和胰蛋白酶，加入2 ml完全培養(yǎng)液，按照1傳2的傳代方法，將細(xì)胞接種到新的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO2、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)。

1.6 成纖維樣滑膜細(xì)胞計(jì)數(shù) 原代培養(yǎng)時(shí)，待細(xì)胞貼壁后，于倒置顯微鏡下分別計(jì)數(shù)不同消化時(shí)間的成纖維樣滑膜細(xì)胞數(shù)。

1.7 成纖維樣滑膜細(xì)胞免疫熒光鑒定 在6 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿上放置無菌蓋玻片，取原代分離的成纖維樣滑膜細(xì)胞，按1×105個(gè)/ml的密度接種在6 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿上，輕微晃動(dòng)使細(xì)胞均勻鋪在培養(yǎng)皿中。培養(yǎng)24 h后，用4%多聚甲醛固定15 min，用PBS溶液洗滌后用含有Triton X-100(檢測(cè)CD90/Thy-1時(shí)為0.1%，檢測(cè)波形蛋白時(shí)為0.3%)與5%牛血清白蛋白的溶液透化1 h，然后分別加入一抗兔波形蛋白抗體(1 μg/ml)和anti-CD90/Thy-1抗體(1∶100)；4℃孵育過夜，PBS溶液洗滌3次，5 min/次，分別加入兔FITC和兔CY3綴合的二抗，在室溫下培養(yǎng)2 h。最后細(xì)胞用4′，6-二脒基-2-苯基吲哚復(fù)染色。使用顯微鏡拍照，用Image J軟件分析結(jié)果。以波形蛋白免疫熒光顯色為綠色、CD 90/Thy-1免疫熒光顯色為紅色作為陽性標(biāo)準(zhǔn)。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以(x±s)表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 成纖維樣滑膜細(xì)胞的原代培養(yǎng)及傳代情況 成功培養(yǎng)出成纖維樣滑膜細(xì)胞，細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好。不同消化時(shí)間的細(xì)胞培養(yǎng)24 h后于倒置顯微鏡下均可觀察到大量細(xì)胞貼壁且呈梭形，并可見成纖維樣滑膜細(xì)胞從組織塊下方爬出，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)細(xì)胞逐漸增多，6 d左右細(xì)胞即可長(zhǎng)滿瓶底，見圖1。隨著傳代次數(shù)的增加，成纖維樣滑膜細(xì)胞體積逐漸增大，生長(zhǎng)周期逐漸變長(zhǎng)，細(xì)胞活性降低，見圖2。

圖1 原代成纖維樣滑膜細(xì)胞

注：A為膠原酶消化12 h培養(yǎng)1 d后的貼壁細(xì)胞；B為膠原酶消化12 h培養(yǎng)6 d后的貼壁細(xì)胞。

圖2 傳代成纖維樣滑膜細(xì)胞

注： A為第一代滑膜細(xì)胞，B為第二代滑膜細(xì)胞，C為第三代滑膜細(xì)胞，均膠原酶消化12 h。

2.2 不同消化時(shí)間的成纖維樣滑膜細(xì)胞計(jì)數(shù)比較 隨著消化時(shí)間的延長(zhǎng)，貼壁細(xì)胞數(shù)逐漸增多，經(jīng)膠原酶消化12 h的貼壁細(xì)胞數(shù)最多(P<0.05)，見表1。

表1 不同消化時(shí)間的貼壁細(xì)胞數(shù)比較(x±s，個(gè))

注：與消化12 h比較，*P<0.05。

2.3 成纖維樣滑膜細(xì)胞的免疫熒光鑒定結(jié)果 免疫細(xì)胞化學(xué)染色顯示波形蛋白和CD90/Thy-1陽性，提示所培養(yǎng)的細(xì)胞是成纖維細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞(見圖3)。

圖3 膠原酶消化12 h成纖維樣滑膜細(xì)胞免疫熒光鑒定結(jié)果(400×)

注：A為成纖維樣滑膜細(xì)胞波形蛋白陽性； B為成纖維樣滑膜細(xì)胞CD90/Thy-1陽性。

3 討 論

滑膜是關(guān)節(jié)囊的內(nèi)層，由一種特殊的結(jié)締組織組成，其產(chǎn)生的潤滑分子透明質(zhì)酸和潤滑素可以有效減少關(guān)節(jié)表面的摩擦[8]。正常的滑膜分為細(xì)胞層和血管層，滑膜細(xì)胞分A、B兩型。A型也稱滑膜巨噬樣細(xì)胞，具有吞噬功能；B型細(xì)胞也稱滑膜成纖維樣細(xì)胞，含有高濃度的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，其功能是分泌透明質(zhì)酸[9-10]。成纖維滑膜細(xì)胞表面標(biāo)志物有波形蛋白、Thy-1(CD90)、細(xì)胞內(nèi)黏附分子(CD54)和血管細(xì)胞黏附分子(CD106)[11]，其中波形蛋白和CD90標(biāo)志物與其他解剖部位成纖維細(xì)胞相同，可以用于鑒別成纖維滑膜細(xì)胞與其他種類細(xì)胞[12]。

滑膜細(xì)胞原代培養(yǎng)主要有酶消化法和組織塊貼壁培養(yǎng)法，目前成纖維樣滑膜細(xì)胞多取材于行關(guān)節(jié)置換的OA患者、OA大鼠和兔模型[13]。通過體外分離培養(yǎng)獲得的滑膜細(xì)胞生長(zhǎng)周期長(zhǎng)，細(xì)胞傳代次數(shù)少，不利于OA的研究。組織塊培養(yǎng)法是在無菌的條件下取出滑膜組織，用無菌的PBS溶液沖洗3遍，然后用眼科剪分離滑膜周圍的脂肪組織并將滑膜剪碎成1～2 mm3的碎塊，將碎塊在細(xì)胞培養(yǎng)瓶底部均勻鋪展，加入2 ml DMEM完全培養(yǎng)液，置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3～5 d更換培養(yǎng)基并小心除去非貼壁組織塊，當(dāng)成纖維樣滑膜細(xì)胞鋪滿70%～80%的瓶底時(shí)傳代[14]。該方法的優(yōu)點(diǎn)是操作步驟簡(jiǎn)單，缺點(diǎn)是從組織塊獲取的細(xì)胞不易貼壁，需要充分剪碎，而且培養(yǎng)周期比較長(zhǎng)，不利于實(shí)驗(yàn)進(jìn)展。酶消化法是在超凈臺(tái)內(nèi)取出滑膜組織，用無菌PBS溶液沖洗3遍，分離滑膜組織，然后將滑膜組織充分剪碎后放入培養(yǎng)瓶中，用0.25%胰蛋白酶(含乙二胺四乙酸)消化30 min，離心棄胰酶，再加入膠原酶消化2 h，最后過濾加入2 ml DMEM完全培養(yǎng)液，置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每24 h換液1次，細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶底時(shí)傳代[15-17]。該方法的優(yōu)點(diǎn)是培養(yǎng)周期比較短，缺點(diǎn)是酶濃度過高或者酶消化時(shí)間過長(zhǎng)都會(huì)對(duì)細(xì)胞造成損傷，降低細(xì)胞傳代活性；而酶消化時(shí)間過短，組織塊消化不充分，消化分離的細(xì)胞比較少，此外細(xì)胞過篩網(wǎng)時(shí)組織塊容易堵塞篩孔而導(dǎo)致濾過的細(xì)胞量比較少，且細(xì)胞容易被污染[18]。因此，如何在短期內(nèi)獲得大量原代滑膜細(xì)胞一直是研究的熱點(diǎn)。

本次實(shí)驗(yàn)采用膠原酶消化法獲取原代滑膜細(xì)胞，培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)既保留了消化完全的組織塊，又保留了消化未完全的組織塊，未消化完全的組織塊貼壁后，在倒置顯微鏡下可見成纖維樣滑膜細(xì)胞從底部爬出。該方法操作簡(jiǎn)單，可在短時(shí)間內(nèi)獲得大量原代滑膜細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，剪碎的組織塊經(jīng)Ⅱ型膠原酶消化12 h后，貼壁細(xì)胞數(shù)量最多，提示消化12 h對(duì)細(xì)胞的損傷程度較小，獲取的細(xì)胞數(shù)較多。袁琴等[19]采用膠原酶消化法培養(yǎng)大鼠膝OA滑膜細(xì)胞，結(jié)果也顯示單獨(dú)采用膠原酶消化法進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)是獲得原代滑膜細(xì)胞的有效方法。程浩等[20]采用膠原酶消化法、分段膠原酶消化法及組織塊法分離成骨細(xì)胞，結(jié)果顯示膠原酶消化法獲取的成骨細(xì)胞數(shù)量多于其他兩種方法，且細(xì)胞存活率高。

綜上所述，采用膠原酶消化法可以成功培養(yǎng)出原代成纖維樣滑膜細(xì)胞，以膠原酶消化12 h最佳。但是隨著傳代次數(shù)的增加，細(xì)胞活性逐漸降低，且細(xì)胞生長(zhǎng)周期逐漸延長(zhǎng)，不利于長(zhǎng)期細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。