張海霞

揚州大學 廣陵學院，江蘇 揚州 225000

癌癥是最常見的死因之一，它以多種方式出現(xiàn)，具有個體特異性，幾乎每個病人都不同。雖然癌癥的病因復雜而且難以捉摸，但事實上它的產(chǎn)生方式主要只有3種：基因缺陷的積累、致癌的環(huán)境以及先天性遺傳。而在腫瘤產(chǎn)生過程中，細胞生長狀態(tài)、細胞存活率和基因組穩(wěn)定性會受到嚴重影響。機體自身調(diào)節(jié)過程中涉及12種信號傳導途徑，大約使用到140個基因[1]。其中，神經(jīng)菌毛素（neuropilin，NRP）對細胞生長及存活狀態(tài)特別重要。NRP作為酪氨酸激酶的輔助受體參與多種信號通路，而這些信號通路又參與血管生成過程，對于血管生物學功能至關(guān)重要。神經(jīng)菌毛素蛋白1（NRP1）是NRP家族的重要一員，在神經(jīng)發(fā)育，血管生成，腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移和免疫等方面發(fā)揮重要作用。當NRP1作為血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）家族的共受體時，可以發(fā)揮結(jié)合或調(diào)節(jié)其他細胞外配體的功能[2]，如 3 型 Semaphorin3（Sema3）、成纖維細胞生長因子（fibroblast growth factor，F(xiàn)GF）家族成員（FGF-1、FGF-2、FGF-4）。VEGF165和 Sema3可以通過被稱為C端規(guī)則的基序（CendR基序：R/KXXR/K，其中X是任何氨基酸）內(nèi)的C端精氨酸殘基與NRP1 b1結(jié)構(gòu)域的多核苷酸相互作用[3]。此外，研究表明NRP1也可以通過血小板衍生生長因子（platelet derived growth factor，PDGF）介導血管平滑肌細胞遷移，進而促進血管生成[4]。由于NRP1在多種腫瘤細胞中的異常表達對腫瘤的發(fā)生發(fā)展起到病理性促進作用，所以NRP1對于腫瘤的發(fā)生發(fā)展是至關(guān)重要的。在此，我們簡要探討NRP1在腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移中的作用，以及以NRP1為靶點治療惡性腫瘤的相關(guān)研究進展。

1 NRP1的基本結(jié)構(gòu)

NRP1基因位于染色體10p12，長約112 kb，由17個外顯子組成[5]。NRP1蛋白相對分子質(zhì)量為 120×103～130×103，為多功能單次跨膜糖蛋白，由胞內(nèi)區(qū)、跨膜區(qū)和一個長的胞外區(qū)組成，胞外區(qū)又分為a1a2、b1b2和c等3個結(jié)構(gòu)域[6]。a1a2大約含有220個氨基酸殘基，Sema3A可與a1a2、b1結(jié)構(gòu)域結(jié)合；b1b2大約含有300個氨基酸殘基，VEGF165通過b1b2結(jié)構(gòu)域與NRP1結(jié)合，具有刺激腫瘤血管內(nèi)皮細胞遷移和增殖的作用，誘導腫瘤內(nèi)新生血管的生成，進而起到促進腫瘤發(fā)生發(fā)展的作用[7-8]；c端可以與跨膜區(qū)同時介導Sema3A的下游信號，發(fā)揮各種生物學過程，如軸突導向、血管生成和腫瘤免疫反應。NRP1已被確定在人類多種惡性腫瘤中高表達[9]，而在相應的正常組織結(jié)構(gòu)中的表達量較低。多種腫瘤細胞的生長活力與NRP1的表達密切相關(guān)，在各種晚期腫瘤中NRP1的豐富表達可以證明這一理論[10-11]。因此，人們對NRP1的靶向治療關(guān)注度與日俱增。

2 NRP1作為輔助受體，增強促血管生成活性

NRP1首次發(fā)現(xiàn)于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)元細胞，特別是在發(fā)育中胚胎的神經(jīng)元細胞的表達更為明顯。此外還發(fā)現(xiàn)NRP1可以在不同組織的血管中表達，特別是動脈血管。隨著個體的不斷發(fā)育，NRP1在動脈內(nèi)皮細胞和腫瘤血管系統(tǒng)中表達，但不在靜脈或淋巴內(nèi)皮細胞上表達[12-15]。NRP1作為VEGF165輔助受體的作用已被人們所熟知。在內(nèi)皮細胞中，NRP主要通過確保VEGF的最佳呈遞以及穩(wěn)定VEGF/VEGFR（VEGF受體）通路的方式增強信號傳導。因此，VEGF165與VEGFR-2的穩(wěn)定結(jié)合及VEGFR-2完全活化需要VEGF165與NRP1的相互作用來實現(xiàn)[16-17]。

遺傳學研究表明，在小鼠體內(nèi)過表達NRP1或靶向失活NRP1基因?qū)τ谛∈髞碚f都是致命的，這不僅可以引起神經(jīng)缺損，還會導致血管網(wǎng)絡缺陷以及心臟發(fā)育解體的嚴重缺陷[15,18]。但是當NRP2基因失活時卻不會引起太嚴重的后果，僅導致小鼠小淋巴管和毛細血管缺陷形成[13]。然而，在NRP1與NRP2基因型雙敲除的小鼠體內(nèi)會發(fā)生很嚴重的血管表型并且導致胚胎8.5 d后死亡[19]。因此，NRP對于血管發(fā)生、血管生成和淋巴管生成是必不可少的。

肝細胞生長因子（hepatocyte growth factor，HGF）是具有著多種功效的細胞因子，能夠有效促進血管生成。HGF的N端能與NRP相互作用，C端能與靶細胞結(jié)合。結(jié)合后，HGF誘導c-met磷酸化，導致幾個下游信號轉(zhuǎn)導因子（包括Grb2、Gab1、STAT3、Shc、SHIP-1、Src和磷脂酰肌醇-3）的募集[20]，進而引起Ras細胞外信號調(diào)節(jié)激酶級聯(lián)通路特異性刺激，激活絲裂原活化蛋白激酶家族中的某些成員。HGF主要通過c-met調(diào)節(jié)內(nèi)皮細胞的存活、增殖、遷移，基質(zhì)沉積和降解，以及毛細管樣結(jié)構(gòu)的形成[21]。有2項研究證明NRP1可以通過增強自分泌HGF/c-met通路的方式在腫瘤進展中發(fā)揮新作用[22-23]，這表明可能NRP1也可以作為HGF的功能性受體發(fā)揮作用。在體內(nèi)實驗中，HGF在多種缺血動物模型中刺激血管生成的效率與VEGF165相似甚至更高，表明NRP1對VEGF165和HGF有著相似的親和力。用siRNANRP1干擾內(nèi)皮細胞NRP1的表達量會引起HGF誘導的c-met磷酸化水平降低，VEGF165和HGF介導的細胞內(nèi)信號傳導受到顯著抑制。同樣地，在小室遷移實驗中加入抗NRP1抗體能夠強烈抑制HGF及VEGF165誘導的HUVEC細胞的侵襲以及血管生成。這些結(jié)果表明，NRP1不僅可以增強VEGF165和HGF在血管內(nèi)皮細胞內(nèi)的表達量，還可以影響內(nèi)皮細胞的增殖、遷移，進一步影響血管的生成。

3 阻斷NRP1可以增強抗VEGF療法的抑制腫瘤生長作用

NRP1功能的缺失可導致血管重塑和分支缺陷[18]，同時加上NRP2功能的喪失會進一步增強血管表型的損失[21]。這些結(jié)果表明，在發(fā)育早期NRP1和NRP2可能具有重疊的功能。但是，在發(fā)育后期每個NRP被分配了不同的功能，NRP1主要表達在動脈而NRP2則在靜脈和淋巴管[24]。作為VEGFR-1和VEGFR-2的共同受體，NRP1可以調(diào)節(jié)VEGF信號傳導，并且以VEGFR非依賴性方式作為叢蛋白A（plexin-A）的共同受體，介導Semaphorins的化學吸收活性[16,25]。實體瘤的癌細胞可以表達不同水平的VEGFR-1，但很少表達VEGFR-2和VEGFR-3，可能這就是它們主要通過NRP1結(jié)合VEGF-A的原因[26-29]。

有研究制備了一種可以和VEGF結(jié)合域結(jié)合的NRP1單克隆抗體，這種抗體可以減少血管發(fā)生和血管重塑，但不會對VEGFR-2介導的其他活動造成影響。通過小鼠視網(wǎng)膜血管重構(gòu)模型研究發(fā)現(xiàn)：①單獨使用這種抗NRP1單抗治療時，對于小鼠視網(wǎng)膜血管重塑有一定的阻礙作用；②單獨使用抗VEGF治療時，對于小鼠視網(wǎng)膜新生血管的復原有阻礙作用；③聯(lián)合使用時，NRP1可能可以通過除了提高VEGFR-2信號傳導以外的機制調(diào)節(jié)內(nèi)皮細胞功能，而且阻斷NRP1功能對VEGFR-2信號傳導影響不大[30]。SK-MES-1是一種非小細胞肺癌異種移植模型。利用該腫瘤模型，發(fā)現(xiàn)阻斷NRP1功能的同時結(jié)合抗VEGF治療能改變腫瘤血管形態(tài)，并進一步降低微血管密度。在單獨使用抗VEGF治療的腫瘤中可見血管改變明顯，血管密度顯著減少，并且與周圍細胞有著非常密切的關(guān)聯(lián)[31]。用抗NRP1和抗VEGF組合治療的腫瘤中血管與周圍細胞聯(lián)系更加密切，同時表現(xiàn)出比單獨使用抗VEGF治療腫瘤更明顯的血管密度降低。

這些數(shù)據(jù)表明，NRP1可能通過其他除VEGF/VEGFR外的通路參與血管的發(fā)生發(fā)展。說明阻斷NRP1功能可以成為提高抗VEGF抗血管生成治療腫瘤的一個有用的方法。

4 Sema3A/NRP1信號阻斷與抗腫瘤免疫相關(guān)

Semaphorins是一個蛋白質(zhì)家族，Sema3是一種分泌蛋白，NRP1可以作為其受體。Sema3A與NRP1的a1a2串聯(lián)結(jié)構(gòu)域結(jié)合，可以導致神經(jīng)生長錐的塌陷和回縮[32]。Sema3A起初被認為是軸突進化的初始因子，現(xiàn)發(fā)現(xiàn)在抑制內(nèi)皮細胞及腫瘤細胞遷移方面也有重要作用。但是Sema3A須與plexin-A1、NRP1形成共受體復合分子，才能進一步介導胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導。缺氧條件可以誘導Sema3A作為腫瘤相關(guān)巨噬細胞（tumor-associated macrophages，TAMS）的吸引劑，通過NRP1和plexin-A1/plexin-A4組成復合受體，觸發(fā)VEGFR-1磷酸化[33]。雖然有數(shù)據(jù)顯示NRP1在缺氧環(huán)境中表達量會下調(diào)，但Sema3A可以以不依賴NRP1的方式介導plexin-A1/plexin-A4繼續(xù)調(diào)節(jié)TAMS。同樣，當巨噬細胞中的NRP1基因缺失時，TAMS在正常氧化腫瘤區(qū)域中仍然發(fā)揮減弱血管生成和免疫抑制功能，從而抑制腫瘤生長和轉(zhuǎn)移。這表明TAMS的異質(zhì)性取決于其所處環(huán)境，由Sema3A/NRP1信號嚴格控制。無血管/缺氧區(qū)域的TAMS代表著一種致命的組合，因為TAMS可以通過改變基因表達譜響應缺氧，形成一種有利于血管生成、轉(zhuǎn)移并抑制抗腫瘤免疫反應的獨特表型[34]。

NRP1在生理條件下是促血管生成性M2型巨噬細胞的標志物。雖然NRP1不直接參與TAMS的募集，但可能參與TAMS進入缺氧區(qū)域，并且NRP1缺失可以引起TAMS的再分布，進而阻滯原位性和自發(fā)性腫瘤的發(fā)生。此外，Sema3A主要通過以NRP1依賴的形式吸引巨噬細胞，同時在同一細胞中當NRP1的表達量下調(diào)時Sema3A會表現(xiàn)出抑制巨噬細胞遷移的效應。這些結(jié)果表明，腫瘤細胞衍生的Sema3A主要負責TAMS通過NRP1信號進入缺氧區(qū)域[35]。與Sema3A介導的吸引或排斥巨噬細胞一致，Sema3A的表達與腫瘤進展和腫瘤抑制相關(guān)[36-37]，揭示了Sema3A/NRP1信號通路在巨噬細胞進入缺氧區(qū)域的指導作用，以及逃避抗腫瘤免疫并促進血管生成的能力。

5 抗原呈遞細胞基因甲基化可以調(diào)節(jié)NRP1蛋白表達

樹突狀細胞（dendritic cells，DC）是目前所知的功能最強大的專職抗原呈遞細胞，分為2個主要的細胞系，即漿細胞樣DC（plasmacytoid DC，pDC）和常規(guī)DC（conventional DC，cDC）。DNA甲基化能引起染色質(zhì)結(jié)構(gòu)、DNA構(gòu)象、DNA穩(wěn)定性及DNA與蛋白質(zhì)相互作用方式的改變，從而控制基因表達。在一組分析有關(guān)增強細胞間相互作用的基因?qū)嶒炛校愿邉┝縉RP1熱激蛋白免疫的小鼠體內(nèi)顯示出基因甲基化現(xiàn)象，確定了基因甲基化與NRP1蛋白表達存在關(guān)聯(lián)。并且這種現(xiàn)象只在以高劑量熱激蛋白免疫的小鼠樣品中看到，在以低劑量熱激蛋白免疫的小鼠樣品中未能觀察到[38-44]。為了確定基因甲基化對NRP1蛋白表達的影響，該實驗室采用不同劑量的NRP1熱激蛋白免疫小鼠，18 h后取出小鼠的淋巴結(jié)細胞分別標記pDC和cDC，分析NRP1的表達情況。發(fā)現(xiàn)無論以任何劑量的熱激蛋白免疫，cDC中NRP1的表達量都沒有增加，但當小鼠免疫高劑量的熱激蛋白時，NRP1+pDC的百分比顯著增加。當分別用高劑量和低劑量熱激蛋白體外聯(lián)合培養(yǎng)pDC后，通過流式細胞術(shù)檢測pDC表面NRP1的表達情況，統(tǒng)計結(jié)果與體內(nèi)現(xiàn)象一致，即當使用高劑量的熱激蛋白處理時，NRP1+pDC的百分比明顯增加。通過qPCR實驗，測定分別以低劑量和高劑量熱激蛋白處理的pDC中NRP1的mRNA表達量，結(jié)果顯示mRNA表達情況與蛋白表達情況一致，當使用高劑量的熱激蛋白處理時，NRP1的mRNA表達水平明顯升高，這些結(jié)果表明抗原呈遞細胞基因甲基化對NRP1蛋白表達有上調(diào)的作用。為了驗證上述結(jié)論，該實驗室在進行流式細胞分析小鼠體內(nèi)pDC前，在小鼠體內(nèi)注射一種能有效抑制DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的蛋白，然后與未使用抑制劑的對照組做比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，使用了抑制劑的小鼠體內(nèi)pDC再次用高劑量的NRP1熱激蛋白孵育后NRP1的表達上調(diào)現(xiàn)象被完全阻斷了。

調(diào)節(jié)性T細胞（regulatory T cells，Tregs）是一類控制體內(nèi)自身免疫反應的T細胞亞群。有文獻報導pDC與Tregs間的相互作用可以促進NRP1的表達[45-47]，用高劑量NRP1熱激蛋白培養(yǎng)pDC，18 h后將Tregs用紅色標記物標記，然后用延時活細胞顯微鏡測量，每15 min間隔拍攝，發(fā)現(xiàn)用大劑量的NRP1熱激蛋白處理可以顯著增加pDC與Tregs間的相互作用時間，并且這種相互作用可以被NRP1抗體阻斷[38]。將普通T細胞和Tregs以上述相同方法處理后與pDC共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)pDC與普通T細胞之間的相互作用時間沒有變化。表明這個現(xiàn)象是Tregs特異性現(xiàn)象，而且普通T細胞不高表達NRP1，說明這種現(xiàn)象屬于NRP1依賴性，因此通過NRP1熱激蛋白刺激pDC，引發(fā)抗原呈遞細胞基因甲基化，可以增加NRP1的表達，延長pDC與Tregs間的相互作用，為研究腫瘤的發(fā)生發(fā)展提供了一個新的方向。

6 人體腫瘤的不良預后與NRP1+/+Tregs增加有關(guān)

Tregs是人體內(nèi)重要的控制自身免疫反應的細胞，其表達的FOXP3轉(zhuǎn)錄因子可以維持免疫穩(wěn)態(tài)，防止過度的組織損傷，缺乏功能性Tregs的人會發(fā)生致死性的自身免疫性疾病。有數(shù)據(jù)顯示通過抑制抗腫瘤免疫會限制自身免疫和維持免疫調(diào)節(jié)[48]。之前已有文獻報道，腫瘤小鼠模型中90%的NRP1由腫瘤浸潤性Tregs表達，并且對它們在腫瘤微環(huán)境中的功能至關(guān)重要[49]。Tregs的脆弱性是指敲除了NRP1的Tregs（NRP1-/-Tregs）是不穩(wěn)定的，雖然仍保留了表達FOXP3轉(zhuǎn)錄因子的能力，但是失去了體外抑制活性。雖然在小鼠體內(nèi)NRP1已被證明可以阻斷Tregs的脆弱性，但其在人類Tregs中的存在情況和作用機制尚不清楚。以前的相關(guān)研究一直存在爭議，一些人認為人類外周Tregs不表達NRP1，而另一些人則認為NRP1+/+Tregs是腫瘤的強效抑制劑[50-54]。分別使用NRP1-/-及NRP1+/+Tregs細胞在黑色素瘤小鼠模型內(nèi)進行評估，發(fā)現(xiàn)高比例的NRP1-/-Tregs可以產(chǎn)生γ干擾素，進而驅(qū)動腫瘤組織周圍的野生型Tregs的脆弱性，促進抗腫瘤免疫。

收集臨床腫瘤病例與健康人進行比較，發(fā)現(xiàn)NRP1+/+Tregs的表達與腫瘤的不良預后相關(guān)。通過條件性細胞剔除的小鼠模型發(fā)現(xiàn)如果減少小鼠體內(nèi)一半的Tregs數(shù)量，腫瘤就會不受限制生長；相反，如果敲除一半Tregs上的NRP1，則腫瘤的生長會受到限制，表明NRP1-/-Tregs在重塑腫瘤微環(huán)境中有積極作用。并且NRP1-/-Tregs對NRP1+/+Tregs腫瘤抑制功能有負調(diào)節(jié)作用。據(jù)報道，NRP1與Sema4a相互作用可以加強Tregs的功能和生存[51]。為了確定在阻斷NRP1/Sema4a通路后，γ干擾素及其受體是否也有表達，用Sema蛋白對B16細胞荷瘤小鼠進行治療，發(fā)現(xiàn)腫瘤組織變小，γ干擾素及其受體的表達增加。證明γ干擾素及其受體的表達確實與NRP1的敲除相關(guān)[55]。事實上除了NRP1的缺失可以導致Tregs的脆弱性，細胞外部的環(huán)境因素也是導致腫瘤內(nèi)Tregs脆弱性的原因[56-57]。

以上數(shù)據(jù)表明，Tregs在腫瘤中可能是有害的，通過免疫抑制功能，它們能夠阻止免疫系統(tǒng)檢測和殺死癌細胞；另外，NRP1蛋白幾乎在所有浸潤的小鼠腫瘤細胞中的Tregs上都有表達，NRP1可以通過抑制天然的抗腫瘤免疫，幫助腫瘤細胞存活；在小鼠體內(nèi)阻斷或敲除Tregs上的NRP1，只影響其在腫瘤中的功能，并不影響Tregs在機體其他部分的作用；當Tregs失去NRP1后，它們不僅有免疫抑制作用，還能成為抗腫瘤免疫的積極參與者。預后較差的癌癥患者中NRP1+/+Tregs亞群的表達水平較高。

7 結(jié)語

隨著對NRP1在腫瘤血管生長、腫瘤細胞轉(zhuǎn)移、腫瘤組織免疫等方面作用機制的深入研究，NRP1的作用越來越多地被發(fā)現(xiàn)，同時越來越多的作用機制和通路也被發(fā)掘。增強NRP1作用的靶向性日趨成為人們關(guān)注的重點。構(gòu)建特異性單鏈抗體被證實可以作為全長單克隆抗體的替代選擇，它提供了更低的免疫原性，改善了藥代動力學特性，可以更好更快地滲透到腫瘤部位。細胞穿透肽作為一種腫瘤穿透肽可以通過NRP1的依賴性外滲作用提高腫瘤物質(zhì)的遞送。2010年發(fā)表的腫瘤穿透肽IRGD應用于抗腫瘤藥物遞送系統(tǒng)中，可以增加抗腫瘤藥物的腫瘤滲透能力，減少毒副作用?，F(xiàn)已證實通過循環(huán)腫瘤穿透肽與NRP1的相互作用可以啟動血管的轉(zhuǎn)胞吞作用途徑，大大提高了腫瘤的靶向治療效果。iRGD與納米顆粒白蛋白（nab）-紫杉醇結(jié)合物和吉西他濱聯(lián)合治療轉(zhuǎn)移性外分泌胰腺癌已于今年開始Ⅰ期臨床試驗。相信NRP1在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的重要作用終將會在人類對抗腫瘤的戰(zhàn)役中扮演舉足輕重的角色。