趙俊亮，吳建勇，葛建軍，王登峰*

（1.新疆呼圖壁種牛場(chǎng)有限公司，新疆 昌吉 831100；2.新疆畜牧科學(xué)院獸醫(yī)研究所（新疆畜牧科學(xué)院動(dòng)物臨床醫(yī)學(xué)研究中心），烏魯木齊 830000）

副結(jié)核病是由副結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium paratuberculosis）感染引起的以頑固性腹瀉、漸進(jìn)性消瘦、腸黏膜增厚并形成皺褶為特征的慢性消化道疾病。該病又稱副結(jié)核性腸炎或約內(nèi)氏?。↗ohne’s disease）[1]。副結(jié)核分枝桿菌可感染牛、羊、鹿等哺乳動(dòng)物和鴿、斑鳩等鳥類。牛、綿羊、山羊等反芻動(dòng)物易感，其中集約化養(yǎng)殖的奶牛和肉牛最為易感[2]。本病可通過(guò)糞口傳播方式由病畜傳染給人和其它動(dòng)物，在我國(guó)被列為二類動(dòng)物疫病[3]。

近年來(lái)，我們發(fā)現(xiàn)新疆一些牛場(chǎng)存在長(zhǎng)期間歇性腹瀉、機(jī)體逐漸消瘦、反復(fù)治療無(wú)明顯改善的臨床病例，初步懷疑為副結(jié)核病病例，采集腹瀉糞便樣品，進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)室相關(guān)檢測(cè)確診了感染的存在。本文就6例確診病例的臨床癥狀進(jìn)行詳細(xì)描述以供獸醫(yī)臨床診斷時(shí)參考。

1 病例基本情況

經(jīng)萋-尼氏抗酸染色和副結(jié)核分枝桿菌特異性基因IS900 PCR擴(kuò)增[4]檢測(cè)確診的6例副結(jié)核臨床病例均為荷斯坦泌乳期奶牛，無(wú)特定發(fā)病時(shí)間，兩年內(nèi)陸續(xù)發(fā)病，發(fā)病年齡在兩歲半至四歲半（30～52月齡）不等，初次發(fā)病時(shí)體況評(píng)分為3.1～3.4[5]，發(fā)生腹瀉前30 d的日均單產(chǎn)為25～38 kg（因所處泌乳階段不同，腹瀉前日單產(chǎn)量差異較大）。

2 臨床癥狀

發(fā)病牛產(chǎn)奶量驟然下降，下降幅度可達(dá)30%以上；早、晚體溫正常。

腹瀉，表現(xiàn)為軟便、排泄物稀薄、含有大量氣泡、水樣便呈噴射狀等不一。發(fā)病初期呈現(xiàn)間歇性，腹瀉2～6 d后停止，間隔5～20 d再次腹瀉，期間奶產(chǎn)量無(wú)恢復(fù)，體溫保持正常，精神狀態(tài)無(wú)顯著變化。腹瀉周期循環(huán)2～3次后，奶產(chǎn)量維持在腹瀉前的30%～60%，體溫正常，隨后再次出現(xiàn)腹瀉時(shí)癥狀加重，并且腹瀉周期縮短，表現(xiàn)頻繁腹瀉。初次發(fā)病3個(gè)月后，顯現(xiàn)出營(yíng)養(yǎng)不良，消瘦，被毛雜亂，體況評(píng)分2.8～3.1。

3 實(shí)驗(yàn)室確診

3.1 萋-尼氏抗酸染色

采取病牛的糞便，盡量采集含腸黏膜糞便，并采取集菌法處理，具體如下[6,7]：在采集的糞便中加3～5倍量0.5%氫氧化鈉攪拌均勻，在55℃水浴中乳化30 min形成均勻的糞便懸濁液，用4層紗布過(guò)濾，濾過(guò)液在 300×g離心 5 min，取上清液，去掉沉淀物，上清液再以1 700×g離心20 min，棄去上清，用沉淀物涂片，然后萋-尼氏抗酸染色，在油鏡下觀察可見(jiàn)成簇、團(tuán)狀或叢狀紅染的細(xì)小菌團(tuán)，菌體呈細(xì)短桿狀，可初步判定該菌為副結(jié)核分枝桿菌。

3.2 分子生物學(xué)檢測(cè)

按照“3.1萋-尼氏抗酸染色”的集菌方法富集細(xì)菌，少量生理鹽水重懸，調(diào)整pH值6.8～7.6，試劑盒提取DNA或者水煮法釋放細(xì)菌DNA，以Primer90/Primer91（Primer90：5’-GTTCGGGGCCGTCGCTTAGG-3’，Primer91：5’-GAGGTCGATCGCCCACGTGA-3’）為引物對(duì)副結(jié)核分枝桿菌特異性基因IS900進(jìn)行PCR 擴(kuò)增檢測(cè)，反應(yīng)程序：94℃ 5 min；94℃ 1 min、58℃ 1 min、72℃ 3 min，30個(gè)循環(huán)；72℃ 7 min，擴(kuò)增結(jié)果出現(xiàn)約340 bp的片段即確定為副結(jié)核分枝桿菌[4,8]。

4 小 結(jié)

副結(jié)核病的傳播速度緩慢，臨床上不同病例的出現(xiàn)間隔時(shí)間較長(zhǎng)，易誤判為無(wú)關(guān)聯(lián)的或非傳染性的內(nèi)科病。實(shí)際上在養(yǎng)殖場(chǎng)該病是一種傳播較為緩慢的地方流行性傳染病。該病主要感染幼畜，其中1月齡前最易感，最少在感染6個(gè)月以后才可能檢測(cè)到抗副結(jié)核分枝桿菌抗體，在2～5歲時(shí)部分感染牛才逐步表現(xiàn)出明顯的腹瀉癥狀[2]。根據(jù)副結(jié)核病的疾病發(fā)展進(jìn)程，可分為臨床后期（持續(xù)大量排菌、腹瀉、消瘦、抗體陽(yáng)性）、臨床期（間接性排菌、抗體陽(yáng)性）、亞臨床期（部分?？蓹z測(cè)到排菌和抗體）和隱蔽期（檢測(cè)不到排菌和抗體）。在副結(jié)核病流行的牛群中，這四期感染牛呈現(xiàn)著1：1-2：4-8：10-14的結(jié)構(gòu)比例，表現(xiàn)出典型的“冰山現(xiàn)象”[9,10]。

該病的臨床診斷要點(diǎn)是：（1）2歲以上的腹瀉牛；（2）持續(xù)、頑固性腹瀉和慢性進(jìn)行性消瘦；（3）出現(xiàn)腹瀉癥狀時(shí)，體溫?zé)o明顯變化，采食和精神狀態(tài)基本正常。

臨床后期和臨床期牛是本病的最主要的傳染源，此時(shí)，副結(jié)核分枝桿菌主要存在于病畜體內(nèi)腸系膜淋巴結(jié)或腸黏膜，通過(guò)糞便大量排出，且對(duì)外界的抵抗力較強(qiáng)，可存活數(shù)月[2]。糞便中存在的副結(jié)核分枝桿菌可通過(guò)污染飲水、飼草料等方式，經(jīng)消化道感染健康牛。一旦牛場(chǎng)出現(xiàn)確診的副結(jié)核病臨床病例，建議采用副結(jié)核分枝桿菌抗體檢測(cè)試劑盒對(duì)8月齡以上的牛進(jìn)行3～4次/年的全面篩查，通過(guò)淘汰陽(yáng)性牛等全場(chǎng)凈化措施控制副結(jié)核病的進(jìn)一步擴(kuò)散流行。