朱仁衡 雷田兵 劉官智 楊 旭

泛發(fā)性體癬指由皮膚癬菌感染引起的皮損較為廣泛的皮膚病，皮損一般超過兩個(gè)部位，如體癬、股癬并發(fā)，也可以是體癬皮損較廣泛，如面部、軀干并發(fā)；軀干、四肢并發(fā)；面部、四肢并發(fā)等情況。我國皮膚癬菌病致病菌種主要為紅色毛癬菌，其次為趾間毛癬菌、石膏樣小孢子菌及犬小孢子菌[1]?，F(xiàn)今對泛發(fā)性體癬的研究較少，以個(gè)案報(bào)道較為多見，對普通體(股)癬和泛發(fā)性體癬致病菌種分布差異性研究未見報(bào)道，對泛發(fā)性體癬患者相關(guān)致病因素分析很少。本實(shí)驗(yàn)對川東北地區(qū)泛發(fā)性體癬進(jìn)行致病菌種分析，并且全面搜集患者相關(guān)致病因素，包括病程、年齡、基礎(chǔ)疾病、使用糖皮質(zhì)激素情況，初探泛發(fā)性體癬的發(fā)生與致病菌種及患者相關(guān)致病因素之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 研究對象 收集2016年1～12月就診于我院皮膚科并診斷為泛發(fā)性體癬的患者，作為A組，并采集臨床菌株及臨床資料。并在同一時(shí)間段隨機(jī)收集部分普通體(股)癬患者作為B組。A組納入標(biāo)準(zhǔn)：①1月內(nèi)未使用抗真菌藥物治療，有典型皮膚癬菌病臨床表現(xiàn)，且皮損部位超過2個(gè)(如體癬、股癬并發(fā),或者體癬皮損較廣泛，如面部、軀干并發(fā)；軀干、四肢并發(fā)；面部、四肢并發(fā)等情況)；②真菌直接鏡檢及真菌培養(yǎng)均陽性。B組納入標(biāo)準(zhǔn)：①1個(gè)月內(nèi)未使用抗真菌藥物治療，有典型體癬或股癬臨床表現(xiàn)，皮損局限；②真菌直接鏡檢及真菌培養(yǎng)均陽性。

排除標(biāo)準(zhǔn)：①1個(gè)月內(nèi)使用過抗真菌藥物治療的患者；②雖有典型皮膚癬菌病臨床表現(xiàn)，但真菌直接鏡檢或真菌培養(yǎng)陰性的患者。

1.2 培養(yǎng)基 SDA(青島高科園海博生物科技有限公司)。

1.3 試劑 真菌DNA提取試劑盒、100 bp DNA ladder(DNA片段)、6×loading buffer(上樣緩沖液)、10×TBE液、ddH20(重蒸水)、引物Its1：5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’、引物Its4：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’(成都飛騰博川生物科技有限公司)；2×Taq PCR MasterMix(Biomiga)；Gold View(Solarbio)；瓊脂糖(Biowest)；氯霉素、放線菌酮(Biosharp,USA)。

1.4 主要儀器 光學(xué)顯微鏡、超凈工作臺(tái)、電熱恒溫培養(yǎng)箱、Labo Autoclvae 高壓蒸汽滅菌鍋、低溫高速離心機(jī)、恒溫水浴箱、PCR儀、電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)。

1.5 真菌鑒定方法 收集皮損邊緣處鱗屑，滴入10%KOH一滴，蓋上蓋玻片，稍等片刻顯微鏡下觀察有無菌絲或孢子，看到菌絲或孢子為鏡檢陽性，拍攝收集照片。收集皮損鱗屑前用75%酒精消毒患處，選擇皮損邊緣處刮取鱗屑，用接種針接種于SDA平皿培養(yǎng)基中央部位(泛發(fā)性體癬患者不同部位皮損分別接種培養(yǎng))。將接種后的SDA平皿放置于28℃電熱恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2周。2周后觀察菌落生長情況，以看到菌落生長為培養(yǎng)陽性，并轉(zhuǎn)種保存菌種。

形態(tài)學(xué)方法鑒定：①收集臨床菌種時(shí)，在顯微鏡下查找菌絲及孢子；②在SDA中觀察菌落形態(tài)、生長速度、培養(yǎng)基形態(tài)及顏色的改變；③用鋼圈法小培養(yǎng)觀察孢子及菌絲的生長情況作出初步鑒定。結(jié)果參照《醫(yī)學(xué)真菌學(xué)-實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)指南》[2]及相關(guān)文獻(xiàn)[3,4]。

分子生物學(xué)方法鑒定：(1)分離提取菌株DNA。(2)采用真菌通用引物ITS1及ITS4擴(kuò)增真菌核糖體基因ITS區(qū)。PCR反應(yīng)體系總體積為20 μL(2×MasterMix 10μL，模板2μL，Its1 1μL，Its4 1μl，ddH2O 6μL)；反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性90s，94℃變性30s，55℃復(fù)性30s，72℃延伸1 min，共30個(gè)循環(huán)，最后75℃再延伸5 min。(3)結(jié)果觀察：取擴(kuò)增產(chǎn)物5μL、DNA ladder 1μL混勻，取混合液5μL上樣于1.5%瓊脂糖凝膠(加有Gold View)，同時(shí)上樣DNA Ladder作為對照，120 V電泳30 min，然后將凝膠放入紫外光燈箱內(nèi)，在紫外光照射下觀察圖像結(jié)果，并拍照(整個(gè)鑒定流程見圖1)。(4)把熒光燈下有發(fā)光條帶所對應(yīng)的PCR產(chǎn)物測序，測序結(jié)果在GenBank上和標(biāo)準(zhǔn)株或者已知的臨床株做比對，得出最終鑒定結(jié)果。

1.6 臨床資料分析 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。

圖1 分離同一患者不同部位皮損致病菌培養(yǎng)于SDA培養(yǎng)基中，觀察菌落形態(tài)，提取真菌DNA，擴(kuò)增真菌核糖體基因ITS區(qū)，測定堿基序列，在NCBI數(shù)據(jù)庫中比對，鑒定病原菌菌種

2 結(jié)果

2.1 真菌鑒定結(jié)果 A組患者各患處菌種鑒定結(jié)果一致，紅色毛癬菌25例，趾間毛癬菌9例，石膏樣小孢子菌2例，斷發(fā)毛癬菌1例；B組中，紅色毛癬菌27例，趾間毛癬菌7例，石膏樣小孢子菌1例(表1)。運(yùn)用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 19.0采用卡方檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果顯示，χ2=1.606，P>0.05，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，泛發(fā)性體癬和普通體(股)癬致病菌種無差異。

表1 A組和B組年齡段分布比較 例

2.2 臨床資料分析結(jié)果 ①泛發(fā)性體癬患者37例病程更長，平均病程(584.92±132.52)天，35例體(股)癬患者平均病程(67.37±14.54)天，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.777，P=0.000)。②在泛發(fā)性體癬患者中，86.5%的患者有長期使用糖皮質(zhì)激素高于體(股)癬患者的14.3%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=37.53，P<0.05)。③兩組患者年齡構(gòu)成比有差別，見表1。從表中可見，泛發(fā)性體癬患者病例數(shù)隨年齡而逐漸增加，41歲以上患者較多，占51.35%；而體(股)癬患者以21～40歲患者稍多，占40%。兩組年齡段分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=2.969,P=0.227)。④A、B組患者中各有8例及5例接觸動(dòng)物的患者，χ2=0.654，P=0.544，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。⑤兩組患者所患基礎(chǔ)疾病有差別，見表2。

A、B組基礎(chǔ)疾病分別為14例(37.84%)和3例(8.57%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=12.523,P=0.000)。A、B組在疾病的構(gòu)成比無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=2.550,P=0.636)。

表2 實(shí)驗(yàn)組和對照組患基礎(chǔ)疾病比較

3 討論

本研究37例泛發(fā)性體癬患者各患病部位感染的真菌經(jīng)鑒定都為同一種真菌，說明泛發(fā)性體癬是由同一種真菌感染了多個(gè)部位導(dǎo)致。本地區(qū)皮膚癬菌病的主要致病菌種以紅色毛癬菌為主。

通過本研究我們發(fā)現(xiàn)泛發(fā)性體癬患者和體(股)癬患者致病菌種的分布并無差異性，都是以紅色毛癬菌為多見。患者免疫力下降、因瘙癢搔抓引起自體傳播或?yàn)閷?dǎo)致泛發(fā)性體癬發(fā)生的原因。國內(nèi)外多例泛發(fā)性體癬報(bào)道，患者均有使用糖皮質(zhì)激素或患有庫興氏綜合征[6，7]。陳慧報(bào)道1例糖尿病10余年患者，出現(xiàn)泛發(fā)性體癬，考慮和患者免疫力下降有關(guān)[8]；王恩波等報(bào)道1例系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者繼發(fā)泛發(fā)性體癬，也考慮疾病本身及長期使用糖皮質(zhì)激素使患者免疫力下降有關(guān)系[9]；Engelhard等報(bào)道1例因骨髓移植后長期使用免疫抑制劑繼發(fā)泛發(fā)性體癬的患者，同樣是因?yàn)榧膊”旧砑笆褂妹庖咭种苿┑脑蛑率够颊呙庖吡ο陆礫10]。

我們對兩組患者的臨床資料進(jìn)行分析得出兩組患者在病程、用藥情況及基礎(chǔ)疾病等方面有差異。泛發(fā)性體癬患者病程更長，可能和患者不重視此疾病，長時(shí)間未治療使皮疹泛發(fā)；泛發(fā)性體癬患者使用糖皮質(zhì)激素藥物的比例明顯高于體(股)癬患者。此外，本次實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)數(shù)例糖尿病患者、系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者、哮喘患者及腫瘤化療后患者繼發(fā)泛發(fā)性體癬，這些疾病也可能使患者免疫功能下降，導(dǎo)致真菌易感染，皮疹泛發(fā)。

國內(nèi)外已有多例泛發(fā)性體癬誤診的報(bào)道，如景東云報(bào)道1例泛發(fā)性體癬誤診為銀屑病，并外用糖皮質(zhì)激素治療致病情加重[11]，Modi也曾報(bào)道1例臨床表現(xiàn)與亞急性皮膚型紅斑狼瘡極其相似的泛發(fā)性體癬患者[12]，劉蔚曾報(bào)道泛發(fā)性體癬患者誤診為皮炎濕疹并外用糖皮質(zhì)激素乳膏致病情加重[13]。臨床工作中，需要注意把銀屑病、副銀屑病、濕疹、特應(yīng)性皮炎、玫瑰糠疹、亞急性皮膚型紅斑狼瘡、環(huán)狀肉芽腫、蕈樣肉芽腫等疾病與之相鑒別[14]。