王 璐，高緒鋒，張鳳麗，胡燕云，黃 穎，徐元宏

臨床上，肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae,KPN)常常引起呼吸道、泌尿道、消化道、血液及其他無菌部位(如腹腔、胸腔、關(guān)節(jié)等)感染[1]。KPN的分離率呈逐年穩(wěn)步上升趨勢，且耐碳青霉烯KPN(CRKP)的檢出率也在逐年上升，至2017年，KPN對亞胺培南和美羅培南的耐藥率達到20.9%和24.0%，耐藥率上升幅度高達8倍[2]。KPN對碳青霉烯類藥物耐藥大多是由于其產(chǎn)碳青霉烯酶，尤以肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶(Klebsiellapneumoniae carbapenemase，KPC)為主。我院自2018年以來，CRKP的檢出率逐漸上升，本研究收集2018年4-6月分離自臨床科室的CRKP 40株，進行碳青霉烯酶基因檢測及菌株同源性分析，以期進一步了解我院CRKP的耐藥性與分子流行病學特征，為有效治療和預防CRKP感染提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 對亞胺培南、美羅培南或厄他培南中任一藥物耐藥定義為CRKP，所有菌株均為連續(xù)分離的非重復菌株，同一病人同一標本只取第1 次分離株。質(zhì)控菌株為大腸埃希菌ATCC 25922，KPN ATCC1705，KPN ATCC1706，大腸埃希菌ATCC 8739，系安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院檢驗科惠贈。KPC、OXA-48、NDM-1陽性對照菌株系中國人解放軍總醫(yī)院檢驗科惠贈。

1.1.2 主要試劑和儀器 MAC平板、BP平板、MH平板及VITEK 2 Compact型全自動微生物分析儀和革蘭陰性菌鑒定藥敏卡(GN和GN13)均購自法國梅里埃公司，美羅培南藥物敏感性紙片(10 μg)購自英國Oxoid公司，胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基(TSB)購自北京三藥公司，PCR儀購自美國BIO-RAD公司，電泳儀及凝膠成像系統(tǒng)購自上海天能科技有限公司，PCR試劑購自日本Takara公司，引物交由生工生物工程有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 菌株分離培養(yǎng)、鑒定與藥敏方法 按照《全國臨床檢驗操作規(guī)程》對臨床菌株進行分離培養(yǎng)。標本分別接種于血平板和麥康凱，35 ℃培養(yǎng)16～18 h，挑取疑似菌落進行種類鑒定。菌種鑒定及藥物敏感性試驗采用法國梅里埃VITEK 2 Compact型全自動細菌鑒定藥敏儀進行，菌株對常用抗菌藥物的敏感性采用梅里埃VITEK 2 Compact GN 13卡進行檢測，試驗操作及折點判斷依據(jù)美國臨床實驗室標準化研究所標準操作規(guī)程(CLSI-M100-27)進行。

1.2.2 改良Hodge(MHT)試驗 將大腸埃希菌ATCC 25922配置成0.5麥氏濁度的菌懸液，稀釋10倍后均勻涂布于MH平板上，在平板中央貼10 μg美羅培南紙片。然后用接種環(huán)挑取單個過夜培養(yǎng)的新鮮菌落，以紙片邊緣為起點離心方向劃線接種，35 ℃孵育16～20 h后觀察結(jié)果。以KPN ATCC 1705為陽性對照，KPN ATCC1706為陰性對照。若被測菌株線與大腸埃希菌ATCC 25922抑菌圈交匯處出現(xiàn)大腸埃希菌生長增強現(xiàn)象，即為陽性[3-4]。

1.2.3 改良碳青霉烯滅活試驗(mCIM試驗) 取1 μL過夜培養(yǎng)的CRKP菌落接種于2 mL TSB 肉湯中，渦旋振蕩15 s，將10 μg美羅培南紙片浸沒于TSB菌液中，35 ℃孵育4 h。待孵育結(jié)束時，將美羅培南紙片從TSB菌液中取出，貼于0.5 麥氏濁度大腸埃希菌ATCC25922涂布的MH 瓊脂平板上，35 ℃孵育18～24 h。KPN ATCC1705為陽性對照，KPN ATCC1706為陰性對照。根據(jù)CLSI M100 27th進行結(jié)果判讀[4]。

1.2.4 耐藥基因檢測 采用煮沸法提取待測菌株的基因組DNA作為模板。取無菌水1 mL加入高壓滅菌后的EP管中，挑取35 ℃、 16～18 h生長的菌落適量在EP管壁研磨制成菌懸液，然后將菌懸液100 ℃加熱30 min，冷卻至室溫后，高速離心取上清液作為PCR擴增的模板。同時使用多對特異引物序列進行多重PCR擴增，按如下設(shè)置擴增條件：預變性94 ℃ 5 min，然后變性94 ℃ 45 s、退火55 ℃ 45 s和延伸72 ℃ 1 min，35個循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。1%的瓊脂糖凝膠電泳觀察CRKP菌株是否攜帶待檢的碳青霉烯耐藥基因。將部分擴增產(chǎn)物送測序公司進行測序，測序結(jié)果在 GenBank 中進行比對分析，以確定擴增產(chǎn)物的種類和型別[5]。引物序列見表1。

表1 碳青酶烯耐藥基因引物序列

1.2.5 同源性分析 CRKP菌株35 ℃過夜后，挑取單個純菌落，將其均勻涂抹于靶板上，放置后滴加1 μL α-腈基-4-羥基肉桂酸基質(zhì)液，待干燥，將靶板放入 VITEK MS 儀器中，使用科研庫進行聚類分析。儀器將細菌蛋白質(zhì)峰圖與數(shù)據(jù)庫里參考圖譜比較并進行多種算法計算，給出鑒定結(jié)果?？尚潘皆?0.0%～99.9%為可接受結(jié)果。然后在系統(tǒng)內(nèi)進行同種細菌間的聚類分析。

1.3 統(tǒng)計學方法 應(yīng)用 Excel 軟件，對數(shù)據(jù)進行排序計算，應(yīng)用 WHONET 5.6軟件對藥敏試驗結(jié)果進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果

2.1 CRKP的分布情況 CRKP 40株中分離自 ICU 病房的占55%，急診科占15%，呼吸內(nèi)科占10%，普外科一病區(qū)和神經(jīng)內(nèi)科二病區(qū)各占5%，神經(jīng)內(nèi)科一病區(qū)、腎臟內(nèi)科及腫瘤內(nèi)科各占2.5%。標本類型中以呼吸道的標本居多，占80%，其次是尿液、血液及分泌物各占5%，胸水和腹水各占2.5%。

2.2 藥敏結(jié)果 40株CRKP對厄他培南及環(huán)丙沙星耐藥率均為100.0%，對亞胺培南耐藥率為92.5%，對阿米卡星耐藥率為80.0%，對三代頭孢菌素類、氨基糖苷類、青霉素類耐藥率均超過90.0%(見表2)。

表2 CRKP菌株對常用抗生素耐藥情況

2.3 MHT、mCIM 試驗及幾種常見的碳青霉烯耐藥基因檢出結(jié)果

2.3.1 MHT、mCIM 試驗結(jié)果 40株 CRKP 中，33株菌 MHT 和 mCIM 試驗均為陽性，2株菌(9號和34號)均為陰性，剩下5株菌都是 MHT 試驗陽性而 mCIM 試驗結(jié)果為陰性(見表3)。

2.3.2 幾種常見的碳青霉烯耐藥基因檢出結(jié)果 KPC、OXA-48、NDM-1 PCR凝膠電泳結(jié)果顯示，32株CRKP攜帶KPC基因，測序后用Gene Bank進行比對，結(jié)果顯示32株KPC基因型均是 KPC-2型。此次試驗未檢出OXA-48及 NDM-1基因(見表3)。部分試驗結(jié)果見圖1～2。

表3 MHT、mCIM 試驗及幾種常見的碳青霉烯耐藥基因檢出結(jié)果

2.4 VITEK MS質(zhì)譜儀同源性分析 按照相似度為80%～100%為同一型別的分類方法，該40株 CRKP 可分為7個型別，A 型34株，占85%，是主要型別，B、C、D、E、F及G型各1株，各占2.5%(見圖3)。

3 討論

耐碳青霉烯的腸桿菌科往往對多種抗生素耐藥嚴重，治療極其困難，而成為全球范圍的公共衛(wèi)生問題，近幾年又以 CRKP 最為突出[6-7]。研究證明，CRKP 的耐藥機制主要是由于攜帶碳青霉烯酶，以KPC為主，該酶因首次在KPN 中被檢出，因此命名為 KPC[8]，是含有絲氨酸殘基的 A 類碳青霉烯酶，由265～269個氨基酸組成。攜帶 KPC 基因的KPN大多數(shù)為多重耐藥菌，因為 KPC 基因存在于帶有耐藥性決定因素的大質(zhì)粒上，其中包括對氨基糖苷類、喹諾酮類、磺胺類等耐藥的質(zhì)粒[9]。CRKP在醫(yī)院內(nèi)廣泛傳播的因素目前尚未研究清楚，但可能與長期接觸急性護理設(shè)施、較高的共病程度、長期使用抗生素以及長期使用留置管和中心靜脈導管等有關(guān)，繼而引起感染[10-11]。CRKP 感染的病人，其住院時間延長，多數(shù)會住進 ICU 病房進行搶救治療，且相較于產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶或?qū)μ记嗝瓜┟舾械腒PN病死率較高[12]。本研究中，CRKP 對多種抗生素的耐藥性普遍較高，對頭孢菌素類、氨基糖苷類和喹諾酮類的耐藥率都在90.0%以上，與其他報道[13-15]相似。有研究[16]表明治療時采用多藥聯(lián)合或選用新的β-內(nèi)酰胺酶抑制劑組合或許有效。

本次試驗中有26株CRKP MHT試驗及 mCIM 試驗陽性且檢出 KPC 基因，4株 MHT 陽性、 mCIM 陰性并攜帶KPC基因。 KPC 基因檢測陽性的菌株 MHT 試驗結(jié)果均為陽性，這與胡仁靜等[17]研究結(jié)果相同。有7株菌 MHT 及 mCIM 試驗陽性，但未檢測到 KPC、OXA-48 及 NDM-1 基因，推測可能攜帶有其他碳青霉烯類耐藥基因，如 VIM、IMP等[18]。還有2株菌 MHT 和 mCIM 試驗均為陰性，且未檢出待測基因，可能與 MHT 和 mCIM 試驗在檢測不同類別碳青霉烯類基因時靈敏度不同、菌株攜帶其他碳青霉烯類耐藥基因或者存在外膜蛋白丟失等其他非耐藥基因因素有關(guān)。本研究中 CRKP 多為 KPC-2 型，這與國內(nèi)報道[15,19-20]相符，但也有研究[21]認為 CRKP 流行菌株多為IMP-4型，但這需要大量數(shù)據(jù)的進一步研究。MALDI-TOF MS在過去十年中給微生物學診斷工作流程帶來巨變[22]。研究表明，MALDI-TOF MS除了在微生物鑒定方面以外，在流行病學分型和耐藥檢測方面同樣具有巨大的潛力，其分型準確度與脈沖場凝膠電泳和多位點序列分型大致相當，且具有快速、經(jīng)濟、方便等優(yōu)點[23-25]。本文中采用MALDI-TOF MS 進行同源性分析，40株 CRKP分為7個類型，其中A 型34株，占85%，B、C、D、E、F 及 G 型各1株，各占2.5%，以A 型為主，主要集中在ICU病房和急診科，同時存在于神經(jīng)內(nèi)科、神經(jīng)外科及普外科一病區(qū)，因此我們認為，本院存在以A型為主的 CRKP 的流行傳播。

綜上所述，我院 CRKP 耐藥程度較高且有流行播散的趨勢，因此院感部門應(yīng)對重點科室加強耐藥監(jiān)測，采取適當措施，嚴格控制進一步的傳播流行。同時后續(xù)應(yīng)當補充其他耐藥基因檢測及進一步研究是否存在外膜蛋白的丟失及藥物泵出等機制，為研究CRKP的傳播機制提供思路。