汪小五，丁圣剛，王林定，唐振華，朱義朗，高 勇

社區(qū)獲得性肺炎中比較常見的病原體就是肺炎支原體(Mycoplasmapneumoniae,MP)[1]。肺炎支原體肺炎(MPP)是一種自限性疾病，但是有時會引起各種肺部疾病如支氣管炎、腦炎、壞死性肺炎，嚴(yán)重者甚至?xí)?dǎo)致死亡[2]。MP感染的流行周期為3～4年[1,3]。MPP還沒有明確的發(fā)病機制，從臨床癥狀分析可能是病原體入侵機體呼吸上皮細胞的纖毛狀上皮細胞或者是機體免疫反應(yīng)的結(jié)果[4]。P1基因具有其自然特性即高度保守性，且隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展可根據(jù)分離株中P1氨基酸序列之間的差異把其分成兩大類型P1-Ⅰ型和P1-Ⅱ型[5]。對MP流行株的基因型進行分析可對其發(fā)病機制和臨床診斷治療進行探討[5]。本實驗收集兒童的肺泡灌洗液標(biāo)本，了解合肥地區(qū)兒童MP流行株基因型的現(xiàn)狀。

1 資料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究對象 選取2013年8月至2016年1月安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院兒科兒童肺泡灌洗液標(biāo)本136例。本研究通過醫(yī)學(xué)倫理委員會審核同意，研究對象同意并簽署知情同意書。-80 ℃保存樣本。

1.1.2 材料來源 MP(FH；ATCC15531)標(biāo)準(zhǔn)菌株(美國ATCC產(chǎn)品)為實驗室保存。

1.1.3 主要試劑 MP快速培養(yǎng)試劑盒購自珠海迪爾生物工程有限公司；細胞基因組DNA提取試劑盒購自北京天根生化有限公司；DNA膠回收試劑盒購自上海生物工程有限公司。

1.1.4 引物 普通PCR引物[6]為含內(nèi)切酶BamH Ⅰ酶切位點的上游引物為5′-TTG GAT CCA AGG GGG TGT GGG CGG A-3′；內(nèi)切酶SalⅠ酶切位點的下游引物為5′-TCG TCG ACG GTG GAG GAG GTG TTT C-3′。BamH Ⅰ酶和SalⅠ酶切位點分別為GGA TCC和GTC GAC。巢式和多重PCR引物參照文獻[7]由上海生物工程有限公司合成。巢式PCR-P1基因的重復(fù)序列RepMP4序列的外內(nèi)側(cè)引物分別為ADH2F/ADH2R：5′-GGC AGT GGC AGT CAA CAA ACC ACG TAT-3′/5′-GAA CTT AGC GCC AGC AAC TGC CAT-3′和內(nèi)側(cè)引物ADH3F/ADH3R：5′- GAA CCG AAG CGG CTT TGA CCG CAT-3′/5′-GTT GAC CAT GCC TGA GAA CAG TAA-3′。P1基因的重復(fù)序列RepMP2/3序列的外內(nèi)側(cè)引物分別為ADH3/MP2/3-R1：5′-CGA GTT TGC TGC TAA CGA GT-3′/5′-AGA TTG ACC TGA GCC TGA AG-3′和內(nèi)側(cè)引物MP2/3-F2/MP2/3-R2：5′-CAC AAG TGG TTC GCG TTC CT-3′/5′-GGC TGG GTG GAA TGG TCT GT-3′。多重PCR-P1基因重復(fù)序列引物為ADH4F：5′-GAC CGC ATC AAC CAC CTT TGC GTT ACG-3′/N1：5′- CCC GGT GGT GGA AGT ATT TT-3′/ 2N2C： 5′-CGA GTT TGC TGC TAA CGA GT-3′/MP2/3-F3： 5′-TCG ACC AAG CCA ACC TCC AG-3′/ R3-1 ：5′-TTG GAA TCG GAC CCA CTT CG-3′/R3-2 ： 5′- CGA CGT TGT GTT TGT GCC AC-3′ /R3-2V 5′-CGG TAT AGC TAA TTT GGT AC-3′ 。

1.2 MP陽性標(biāo)本的篩查和基因分型

1.2.1 肺泡灌洗液的收集 行纖維支氣管鏡術(shù)，取液體標(biāo)本在1 h內(nèi)處理標(biāo)本，保存于-80 ℃待實驗。

1.2.2 MP(FH；ATCC15531)標(biāo)準(zhǔn)菌株培養(yǎng) 嚴(yán)格按照實驗室購買的MP快速培養(yǎng)試劑盒說明書中的步驟操作。

1.2.3 普通PCR法篩查MP陽性標(biāo)本 cDNA提取：-80 ℃取出136份肺泡灌洗液標(biāo)本和MP(FH；ATCC15531)標(biāo)準(zhǔn)菌株轉(zhuǎn)陽培養(yǎng)液按細胞基因組DNA提取試劑盒提取基因組DNA。普通PCR技術(shù)篩查MP陽性標(biāo)本。

1.2.4 MP陽性標(biāo)本的基因分型 P1基因的重復(fù)序列RepMP4序列和RepMP2/3序列的外側(cè)引物和內(nèi)側(cè)引物以及試劑盒提取的基因組DNA模板按照巢式PCR擴增體系進行擴增。外側(cè)擴增體系為50 μL總體積：RepMP4序列退火溫度為75 ℃ 30 s；RepMP2/3序列退火溫度為61 ℃ 30 s。內(nèi)側(cè)擴增體系為50 μL總體積：RepMP4序列退火溫度為73 ℃ 30 s；RepMP2/3序列退火溫度為65 ℃ 30 s。多重PCR進行分型擴增體系為50 μL總體積：RepMP4序列退火溫度為70 ℃ 30 s，DNA模板為巢式PCR RepMP4序列擴增產(chǎn)物稀釋1 000倍；RepMP2/3序列退火溫度為70 ℃ 30 s，DNA模板為巢式PCR RepMP4序列擴增產(chǎn)物稀釋1 000倍。

1.2.5 MP陽性標(biāo)本擴增條帶確定 1%瓊脂糖凝膠電泳驗證及基因測序。

2 結(jié)果

2.1 MP陽性標(biāo)本的篩查 普通PCR法對從肺泡灌洗液中提取的基因組DNA中進行擴增，1%瓊脂糖凝膠電泳后顯示有513 bp目的條帶(見圖1)。136例標(biāo)本中檢測出52例MP陽性標(biāo)本，陽性率為38.2%。

2.2 MP陽性標(biāo)本的基因分型 1%瓊脂糖凝膠電泳分析MP陽性標(biāo)本巢式多重PCR擴增產(chǎn)物發(fā)現(xiàn)：RepMP4重復(fù)序列擴增出了大約343 bp條帶；RepMP2/3重復(fù)序列擴增出了大約394 bp 條帶(見圖2)。FH標(biāo)準(zhǔn)菌株則在RepMP4重復(fù)序列擴增出了大約560 bp條帶；RepMP2/3重復(fù)序列擴增出了大約617 bp 條帶(見圖3)?；蛐蛄袦y序匹對后正確。

3 討論

肺炎是兒童和青少年常見的呼吸道感染引起的一種疾病，往往發(fā)病都考慮為細菌或者病毒感染引起，會常常忽略支原體的感染而延誤治療[8]?？焖贉?zhǔn)確的檢測方法非常重要。MP檢測的金標(biāo)準(zhǔn)是培養(yǎng)法，但是其培養(yǎng)時間長，市場快速培養(yǎng)試劑盒檢出率又低[9]。核酸檢測方法是近年來比較流行的檢測方法，可直接從呼吸道標(biāo)本中檢測出病原體特殊的DNA片段[8]。本實驗收集了行纖維支氣管鏡術(shù)兒童肺泡灌洗液標(biāo)本進行普通PCR擴增檢測其感染MP的情況，發(fā)現(xiàn)136例疑似感染MP標(biāo)本中有52例是擴增陽性結(jié)果，其感染率為52.8%。該數(shù)據(jù)可以反映合肥地區(qū)兒童在近期感染MP情況。

MP基因型依賴于P1基因的快速循環(huán)PCR(Rapid-Cycle PCR)和PCR-限制性長度多態(tài)性分析(RFLP)方法[10]。本實驗室采用巢式多重PCR技術(shù)對52例陽性標(biāo)本進行了分析：均擴增出了P1-Ⅰ

型的目的條帶。對照組擴增出P1-Ⅱ型的目的條帶。該數(shù)據(jù)可以反映合肥地區(qū)兒童感染MP流行基因型均為P1-Ⅰ型。

王楠等[5]檢測西安地區(qū)兒童感染MP流行基因型均為P1-Ⅰ型。KENRI等[7]采用的巢式多重PCR的方法將1995-2005年十年間的MP菌株進行了分型發(fā)現(xiàn)P1-Ⅰ型和P1-II型交替存在并發(fā)現(xiàn)了變異株。本實驗未能發(fā)現(xiàn)亞型，可能是由于樣本量的局限。

收集來的136份肺泡灌洗液標(biāo)本中有52份是MP陽性標(biāo)本，即合肥地區(qū)兒童MP的感染率為38.2%，而且全部為P1-Ⅰ型。該調(diào)查結(jié)果初步說明合肥地區(qū)兒童感染MP主要為P1-Ⅰ型。雖然樣本量有限，后期還會繼續(xù)擴大樣本量，來補充實驗數(shù)據(jù)的不足，但是該結(jié)果對臨床治療還是有一定的指導(dǎo)意義。