張松松，靳 偉，李紅梅，吳成柱

廣玉蘭又名荷花玉蘭，是木蘭科木蘭屬植物，為常綠闊葉大葉喬木?！逗现参镏尽分杏涊d廣玉蘭的樹(shù)皮、花及葉入藥，具有祛風(fēng)散寒、行氣鎮(zhèn)痛的功效，可治療外感風(fēng)寒頭痛、鼻塞、嘔吐腹瀉、高血壓、偏頭痛等[1]。廣玉蘭中含有多種化學(xué)成分，如生物堿類(lèi)、黃酮類(lèi)、木脂素類(lèi)、萜類(lèi)、倍半萜內(nèi)酯、脂肪酸類(lèi)等[2-4]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究[4-7]表明，廣玉蘭具有抗炎、抗氧化、抗驚厥、抑制平滑肌等作用。近期，本課題組對(duì)廣玉蘭果實(shí)的化學(xué)成分及抗腫瘤活性進(jìn)行研究過(guò)程中，首次獲得了新穎結(jié)構(gòu)的新木脂素類(lèi)化合物雙和厚樸酚A[8]。新木脂素類(lèi)化合物是由C6-C3骨架的苯丙素氧化聚合而成，具有較強(qiáng)的生物活性，如抗腫瘤作用、肝保護(hù)和抗氧化作用、抗人類(lèi)免疫缺陷病毒作用等[9]。然而，目前對(duì)廣玉蘭果實(shí)中有關(guān)雙和厚樸酚A提取工藝的研究未曾報(bào)道。因此，本研究以廣玉蘭果實(shí)為原料，考察提取溶媒、料液比、浸泡時(shí)間及提取次數(shù)等因素，并以L(fǎng)9(34)正交試驗(yàn)篩選出最佳提取條件，為廣玉蘭資源的綜合利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器 XFB-200型小型粉碎機(jī)(吉首市忠誠(chéng)制藥機(jī)械廠(chǎng))，梅特勒-托利多XP205型分析天平(瑞士梅特勒-托利多公司)，SPD-15C型反相高效液相色譜儀[日本島津企業(yè)管理(中國(guó))有限公司]，KQ5200B型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)，IKARV10型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海人和科學(xué)儀器有限公司)，Milli-QBiocel型超純水儀(美國(guó)Millipore公司)，Anke TGL-16B型高速離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠(chǎng))，色譜柱SunFireTMC18(4.6×250 mm,5 μm，美國(guó)Waters公司)。

1.2 試劑 藥材采集于自蚌埠醫(yī)學(xué)院內(nèi)(經(jīng)鑒定為木蘭科木蘭屬植物廣玉蘭的果實(shí))，無(wú)水乙醇(分析純)、無(wú)水甲醇(分析純)、色譜甲醇、乙酸乙酯、二氯甲烷、正己烷(天津大茂化學(xué)試劑廠(chǎng))，雙和厚樸酚A標(biāo)準(zhǔn)品(本課題組從廣玉蘭中分離純化得到)，乙腈(色譜純，美國(guó)TEDIA公司)，水(雙蒸水，來(lái)自Milli-QBiocel 超純水儀)。

1.3 測(cè)定條件和溶液配制

1.3.1 色譜條件 采用SunFireTMC18(4.6×250 mm,5 μm)色譜柱，流動(dòng)相為乙腈∶水(75∶25，V/V)，流速為1.0 mL/min，柱溫25 ℃，進(jìn)樣量為20 μL，檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm。

1.3.2 供試品溶液的配制 分別稱(chēng)取8份廣玉蘭果實(shí)粉末。第1份：取細(xì)粉末12 g，加水500 mL加熱煮沸45 min，得濾液備用。第2份：取細(xì)粉末12 g，加無(wú)水甲醇100 mL熱回流3次，每次1 h，過(guò)濾，合并濾液備用。第3份：取細(xì)粉末12 g，加無(wú)水甲醇200 mL浸泡48 h，過(guò)濾，得濾液備用。第4份：取細(xì)粉末12 g，加無(wú)水乙醇100 mL熱回流3次，每次1 h，過(guò)濾，合并濾液備用。第5份：取細(xì)粉末12 g，加無(wú)水乙醇200 mL浸泡48 h，過(guò)濾，得濾液備用。第6份：取細(xì)粉末20 g，加乙酸乙酯100 mL浸泡48 h,過(guò)濾，得濾液備用。第7份：取細(xì)粉末20 g，加二氯甲烷100 mL浸泡48 h，過(guò)濾，得濾液備用。第8份：取細(xì)粉末20 g，加正己烷100 mL浸泡48 h，過(guò)濾，得濾液備用。

1.3.3 對(duì)照品溶液的配制 精密稱(chēng)取雙和厚樸酚A標(biāo)準(zhǔn)品1.0 mg，并用色譜甲醇稀釋成不同濃度的對(duì)照品溶液。

1.4 方法學(xué)考察

1.4.1 專(zhuān)屬性 分別吸取對(duì)照品溶液和供試品溶液20 μL，注入HPLC色譜儀，并在上述色譜條件下進(jìn)行分析。

1.4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制 精密稱(chēng)取雙和厚樸酚A標(biāo)準(zhǔn)品并將其稀釋成0.94 mg/mL，再將其等倍數(shù)稀釋成9份，其質(zhì)量濃度分別為470.000、235.000、117.500、58.750、29.375、14.688、7.344、3.672、1.836 μg/mL。進(jìn)樣量均為20 μL，測(cè)得峰面積。分別吸取上述系列濃度溶液，注入HPLC色譜儀進(jìn)行分析，并記錄峰面積。

1.4.3 精密度 取雙和厚樸酚A標(biāo)準(zhǔn)品1 mg并稀釋成1 mg/mL，在同一天內(nèi)對(duì)同一份樣品連續(xù)測(cè)定6次，用相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差來(lái)計(jì)算日內(nèi)精密度。

1.4.4 重現(xiàn)性 取廣玉蘭果實(shí)粉末正己烷提取的浸膏5.75 mg，用色譜甲醇將其稀釋成5.75 mg/mL，在色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)其峰面積和RSD值。

1.4.5 穩(wěn)定性 取廣玉蘭果實(shí)粉末正己烷提取浸膏9.3 mg，用色譜甲醇將其溶解稀釋成9.3 mg/mL，分別于0、2、4、6、8、10、24 h進(jìn)樣，測(cè)峰面積并計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)值。

1.5 正交試驗(yàn) 稱(chēng)取廣玉蘭果實(shí)粉末10 g，選擇正己烷為提取溶劑，以料液比(A)、浸泡時(shí)間(B)、提取次數(shù)(C)為考察指標(biāo)，按照L9(34)正交表進(jìn)行試驗(yàn)，因素水平表見(jiàn)表1。

表1 試驗(yàn)因素計(jì)劃表

2 結(jié)果

2.1 方法學(xué)評(píng)價(jià)

2.1.1 專(zhuān)屬性考察 按照“1.3.1色譜條件”下進(jìn)行分析，待測(cè)組分峰形良好(見(jiàn)圖1)。雙和厚樸酚A(對(duì)照品)保留時(shí)間為10.8 min，溶媒提取浸膏中雙和厚樸酚A與其他雜質(zhì)峰可達(dá)到基線(xiàn)分離。

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制 以峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，濃度為橫坐標(biāo)(X),得線(xiàn)性回歸方程為Y=4.5E+7X-53 724，r=0.9996(n=9)，表明雙和厚樸酚A在0.184～470 μg/mL濃度范圍內(nèi)具有良好的線(xiàn)性關(guān)系。

2.1.3 精密度 取雙和厚樸酚A標(biāo)準(zhǔn)品并配置成1 mg/mL，在同一天內(nèi)對(duì)同一份樣品連續(xù)進(jìn)樣6次，按“1.3.1色譜條件”進(jìn)行分析。用RSD來(lái)計(jì)算日內(nèi)精密度，RSD為0.68%，表明儀器精密度良好(見(jiàn)表2)。

2.1.4 重現(xiàn)性 取廣玉蘭果實(shí)粉末正己烷提取浸膏5.7 mg，用色譜甲醇將其稀釋成5.7 mg/mL，在色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)其峰面積和并計(jì)算RSD為1.61%(見(jiàn)表3)。

2.1.5 穩(wěn)定性 取廣玉蘭果實(shí)粉末正己烷提取浸膏9.3 mg，用色譜甲醇將其溶解配制成9.3 mg/mL，分別取常溫放置不同時(shí)間(0、2、4、6、8、10、24 h)的供試品溶液進(jìn)行分析，測(cè)峰面積并計(jì)算RSD值(見(jiàn)表4)，RSD為1.39%，表明供試品溶液在常溫放置24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

表2 雙和厚樸酚A標(biāo)準(zhǔn)品的精密度試驗(yàn)結(jié)果

表3 用正己烷提取廣玉蘭果實(shí)粉末的重現(xiàn)性試驗(yàn)結(jié)果

2.2 提取工藝的優(yōu)化 取各種溶媒浸泡所得的浸膏進(jìn)樣，通過(guò)測(cè)得的峰面積進(jìn)行比較(見(jiàn)表5)。從實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)比較可以發(fā)現(xiàn)，正己烷浸泡法提取的有效成分量最多；但為了進(jìn)一步確定正己烷的投料比、浸泡時(shí)間、提取次數(shù)等因素的影響關(guān)系，為此設(shè)計(jì)了正交實(shí)驗(yàn)。

表4 廣玉蘭藥材粉末正己烷提取浸膏的穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

表5 各種溶媒提取浸膏的含量測(cè)定結(jié)果

2.3 正交試驗(yàn)優(yōu)化提取工藝 以雙和厚樸酚A含量為指標(biāo)，各因素對(duì)正己烷提取結(jié)果影響大小依次為A>B>C，即料液比為最主要影響因素；不同因素內(nèi)各水平對(duì)結(jié)果的影響強(qiáng)弱為：A2>A1>A3；B3>B1>B2；C2>C1>C3；其最佳因素水平組合為A2B3C2，即料液比為1∶30、浸泡時(shí)間為48 h、提取次數(shù)為3次(見(jiàn)表6)。研究結(jié)果顯示，因素A和B具有顯著影響(P<0.05)，因素C無(wú)顯著影響(P>0.05)(見(jiàn)表7)。

3 討論

廣玉蘭果實(shí)中的有效成分為聯(lián)苯型新木脂素類(lèi)化合物，雙和厚樸酚A顯示出一定的抑制腫瘤細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)凋亡的能力[8]。有研究[10-12]報(bào)道，厚樸酚(magnolol)、和厚樸酚(honokiol)及和厚樸新酚(obovatol)等新木脂素類(lèi)化合物具有多種顯著的生物學(xué)活性，如抗腫瘤、抗病毒、抗血小板、抗炎等。因此，本研究選取新木脂素類(lèi)化合物雙和厚樸酚A為指標(biāo)成分，采用正交試驗(yàn)進(jìn)行了提取工藝優(yōu)化。參考藥用植物中活性成分的含量測(cè)定的相關(guān)文獻(xiàn)[3,13-15]，本研究采用反相高效液相色譜法測(cè)定了正交設(shè)計(jì)提取獲得的樣品，具有較好的靈敏度和準(zhǔn)確度。

表6 L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

表7 正交試驗(yàn)方差分析表

本研究通過(guò)不同溶媒提取比較、溶劑濃度、溶劑體積、提取時(shí)間等因素的考察，確立正交試驗(yàn)因素計(jì)劃表，并用正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)進(jìn)行篩選得到了最佳提取工藝為正己烷作為提取溶媒、料液比為1∶30、浸泡時(shí)間為48 h、提取次數(shù)為3次，在該試驗(yàn)條件的確定下同時(shí)進(jìn)行了穩(wěn)定性和重復(fù)性試驗(yàn)，證明該提取方法切實(shí)可行。但是，在提取過(guò)程中也嘗試了其他的溶媒提取(如甲醇、乙醇)，發(fā)現(xiàn)提取后雙和厚樸酚A發(fā)生降解并且提取效率低下，其可能與雙和厚樸酚A在極性大的溶劑中的穩(wěn)定性相關(guān)。

本研究首次通過(guò)正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)對(duì)廣玉蘭果實(shí)中雙和厚樸酚A的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，其方法簡(jiǎn)單可行、合理、穩(wěn)定性好。