二氧化鈦涂層外固定支架鈦螺釘預(yù)防釘?shù)栏腥镜膶嶒炑芯?/h1>
2019-02-19 05:45:56劉少揚張鐵騎余月明王明海
蚌埠醫(yī)學(xué)院學(xué)報 2019年1期
劉少揚，張鐵騎，余月明，王 軍，錢 光，周 雷，王明海
隨著現(xiàn)代社會交通的發(fā)展，高能量損傷及多發(fā)性軟組織損傷愈來愈多見。外固定支架在治療嚴(yán)重軟組織損傷及復(fù)雜開放性下肢骨折有其獨特優(yōu)勢，但其大量應(yīng)用的同時所帶來的各種并發(fā)癥也越來越引起人們重視。其中，應(yīng)用外固定支架最常見的并發(fā)癥為釘?shù)栏腥?，研究[1-2]顯示,臨床工作中這種并發(fā)癥的發(fā)生率甚至超過了50%，而且采用外固定支架治療的病人中有1%發(fā)生了嚴(yán)重的釘?shù)栏腥?。外固定支架固定的穩(wěn)定性是其最關(guān)鍵和最基本的要求，而釘?shù)栏腥究稍斐陕葆斔蓜佑绊懲夤潭艿姆€(wěn)定性，甚至?xí)?dǎo)致骨髓炎，嚴(yán)重影響病人的病情恢復(fù)[3]，因此尋找更好的預(yù)防釘?shù)栏腥镜姆椒ň哂兄匾饬x。
隨著新一代材料的問世及對微生物致炎機制理解的加深，研究[4-5]證實二氧化鈦(TiO2)的光催化特性可有效抑制細(xì)菌增殖，并且此類特性已被廣泛地應(yīng)用于水質(zhì)、土壤和空氣凈化、自清潔等多種領(lǐng)域。本實驗旨在采用陽極氧化技術(shù)制作TiO2涂層鈦螺釘，通過建立兔脛骨骨折合并金黃色葡萄球菌感染模型，對比觀察術(shù)后兔感染、日?；顒拥纫话闱闆r，定期進行影像學(xué)檢查，通過HE染色、細(xì)菌培養(yǎng)等檢查，評價TiO2涂層外固定支架鈦螺釘?shù)目咕Ч?/p>
1 材料與方法
1.1 TiO2涂層螺釘?shù)闹苽?采用陽極氧化法制備TiO2涂層。經(jīng)過拋光和超聲波清洗后，采用含有0.3wt%NH4F和2vol%H2O的乙二醇電解液，采用陽極氧化法制作TiO2涂層，陽極氧化時間控制在3.5～4 h。通過X射線衍射分析(ESCA5800，ULVAC-PHI，Chigasaki，日本)和掃描電鏡(日本日立S-4800，東京，日本)分別評價TiO2涂層的純度和厚度。
1.2 TiO2涂層螺釘體外抑菌實驗 取普通鈦螺釘和經(jīng)陽極氧化處理過的TiO2涂層螺釘各5枚進行抑菌實驗，分為普通螺釘組(TS組)和TiO2涂層組(TC組)。將螺釘進行常規(guī)高溫高壓滅菌后放置在已接種金黃色葡萄球菌菌株(金黃色葡萄球菌 ATCC25920，中原生物)的固體培養(yǎng)基中。整個操作過程中在超凈臺下完成，避免雜菌污染。將固體培養(yǎng)基放置恒溫箱(37℃)中孵化(加常規(guī)光照)，10 h后觀察抑菌圈直徑。
1.3 釘?shù)栏腥灸Ｐ偷慕?30只新西蘭大耳白兔(雄性)SPF環(huán)境下適應(yīng)性喂養(yǎng) 1 周(新西蘭大耳白兔達3月齡)確定健康后，隨機分為釘?shù)澜M(MO組) 和TiO2涂層螺釘組(TG)各15只，將飼養(yǎng)觀察1周后的新西蘭大耳白兔固定在手術(shù)臺上，自耳緣靜脈注射3%戊巴比妥注射液(劑量1 mL/kg)，麻醉成功后，右小腿外側(cè)剃毛，聚維酮碘溶液消毒皮膚，鋪一次性無菌巾，帶無菌手套，自右脛骨臏下外側(cè)縱行切開長約2.5 cm的切口，切開皮膚皮下達骨膜，鈍性剝離并切除骨膜，顯露脛骨干骺端至脛骨中段，2.7 m鉆頭高速鉆孔至對側(cè)(2孔，間距為4 mm)，脛骨中段2.0 m鉆頭高速鉆孔至對側(cè)(2孔，間距為4 mm)。植入外固定架，脛骨干骺端TG組和MO組分別植入TiO2涂層螺釘和普通螺釘；脛骨中段2組均植入普通螺釘。選取脛骨中上段線橫行鋸斷脛骨，沖洗后逐層縫合。術(shù)后在脛骨干骺端釘?shù)捞?組分別滴入0.1 mL 1×108CFU/mL的ATCC25920金黃色葡萄球菌菌液。術(shù)后動物隔離分籠飼養(yǎng)，自由飲食。兔籠常規(guī)日光燈光照。
1.4 一般觀察指標(biāo) 觀察動物術(shù)后感染、日?；顒拥惹闆r，對術(shù)后1 d、第1周、第4周外固定架拍照2次(注意包含釘?shù)乐車浗M織)。每張釘?shù)勒掌捎妹しㄔu估軟組織炎性程度，釘?shù)栏腥拒浗M織炎性程度評分見圖1。3個本課題組成員評分后取均值。軟組織炎性評分見表1[6]。
1.5 細(xì)菌培養(yǎng)和計數(shù) 術(shù)后1 d、1周及4周時，TG組和MO組分別隨機處死兔子5只，拔除外固定架后，迅速將無菌棉簽插入脛骨干骺端螺釘釘?shù)纼?nèi)，5 min后取出放入25 mL 0.85%氯化鈉溶液的離心管中，放入均質(zhì)器(8 000 r/min處理2 min)混勻。然后通過Baird-Parker平板計數(shù)法進行細(xì)菌計數(shù)，將1/10、1/100和1/1 000的稀釋液接種到Baird-Parker瓊脂平板中，置于37 ℃恒溫箱中16 h，計算細(xì)菌數(shù)量。
1.6 影像學(xué)檢查 術(shù)后1 d、1周、4周末行脛骨X線檢查，對比骨折端對位情況，觀察骨折端骨痂生長情況，判斷骨折端愈合的差異。
1.7 組織學(xué)評估(HE染色) 術(shù)后1 d、1周、4周末取釘?shù)乐車浗M織和骨組織進行石蠟包埋固定，HE染色。HE染色病理切片平面與釘?shù)垒S線平行且經(jīng)過釘?shù)肋吘?，以便于由淺及深觀察釘?shù)乐車浗M織感染以及骨組織炎性浸潤情況。
1.8 統(tǒng)計學(xué)方法 采用t(或t′)檢驗。
2 結(jié)果
2.1 TiO2涂層螺釘?shù)闹谱骷肮獯呋志鷮嶒?能譜分析表明，氧原子與鈦原子的摩爾比約為2∶1，在鈦螺釘表面形成的材料是TiO2。掃描電子顯微鏡測量顯示氧化產(chǎn)生的TiO2膜均勻，膜厚約為2 μm(見圖2)。
2.2 TiO2涂層螺釘體外光催化抑菌實驗結(jié)果 10 h后瓊脂培養(yǎng)基菌落開始形成(見圖3A、圖3B)。TiO2涂層螺釘周圍可見明顯抑菌圈，而普通螺釘未見明顯抑菌圈。TC組的抑菌圈半徑(測量抑菌圈半徑，以螺釘中央為點，垂直于螺釘軸分別測量螺釘中央距離兩側(cè)抑菌圈的距離)較TS組大[(2.96±2.86)cm vs (33.96±6.10)cm，t=10.29,P<0.01],TiO2涂層螺釘在可見光照下較普通鈦螺釘能夠明顯抑菌。
2.3 釘?shù)儡浗M織炎性程度 術(shù)后1 d、1周和4周軟組織炎性程度評分MO組均高于TG組(P<0.05～P<0.01)(見表2)。
表2 2組釘?shù)栏腥拒浗M織外觀評分比較分)
2.4 細(xì)菌培養(yǎng)和計數(shù)結(jié)果 術(shù)后1 d細(xì)菌數(shù)(對數(shù)值)2組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。術(shù)后1周和術(shù)后4周，TG組細(xì)菌數(shù)量(對數(shù)值)均較MO組下降(P<0.01)(見表3)。
表3 2組釘?shù)婪置谖锛?xì)菌培養(yǎng)計數(shù)比較
2.5 影像學(xué)檢查結(jié)果 脛骨X線攝片結(jié)果顯示，術(shù)后1周時TG組(見圖4A)較MO組(見圖4B)對位好，且骨痂量較MO組多，TG組1周時骨折線開始模糊，而MO組骨折線仍較清晰。4周時，TG組(見圖4C)骨折端已到達骨性愈合，骨折端對位對線可；MO組(見圖4D)骨折端位移仍較明顯，骨折線已模糊，但骨髓腔尚未相通，未達到骨性愈合。
2.6 HE染色結(jié)果 MO組在術(shù)后1 d時軟組織HE染色可見大量中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞及漿細(xì)胞浸潤；1周時炎性細(xì)胞浸潤更明顯，局部可見灶狀壞死；4周時釘?shù)纼?nèi)可見大量滲出物，纖維組織增生和灶狀壞死并存。而TG組軟組織HE染色則僅在釘?shù)乐車娚倭垦仔约?xì)胞浸潤(見圖5)。骨組織的HE染色，MO組術(shù)后1 d、1周、4周均表現(xiàn)為釘?shù)纼?nèi)大量炎性細(xì)胞浸潤，部分骨組織螺紋破壞吸收；而TG組則表現(xiàn)為釘?shù)缆菁y清晰無破壞及吸收現(xiàn)象，釘?shù)纼?nèi)炎性細(xì)胞滲出較少(見圖6)。
3 討論
大量實驗[7-9]表明，TiO2可以在可見光紫外線波段下產(chǎn)生氧自由基，從而抑制細(xì)菌的增殖和黏附?？梢酝茰y，TiO2的光催化抗菌特性可能用于防止釘?shù)栏腥?。在紫外光下，TiO2材料可以產(chǎn)生具有強大氧化還原能力的電子空穴對，該電子空穴繼而與周圍的水及氧氣產(chǎn)生活性氧類等一系列羥基基團結(jié)合，短時間內(nèi)達到去污和殺菌的目的。ZUCCHERI等[10]則通過實驗證實，雖然紫外光只占日光總量的4%左右，但是可見光中的紫外部分就足以被TiO2利用借以催化殺菌，而涂層的納米程度則可增加光催化的效率。本實驗中，我們用陽極氧化法制作的TiO2涂層螺釘在可見光下顯示出明顯地抑菌效果。一般來說，螺釘周圍的皮膚是防止微生物入侵的第一道重要防線。我們的研究揭示了TiO2涂層螺釘可以有效的預(yù)防釘?shù)栏腥?，且有持續(xù)的抗菌效果。KOSEKI等[11]研究發(fā)現(xiàn)，TiO2涂層螺釘?shù)墓獯呋匦栽诖笫竽Ｐ椭芯哂辛己玫男Ч哂酗@著的抑菌能力(76.7%抑制)。本文結(jié)果發(fā)現(xiàn)術(shù)后1 d，TG組的細(xì)菌數(shù)就少于MO組，而且在第1周和第4周，TG組細(xì)菌數(shù)則明顯少于MO組，顯示TiO2涂層螺釘良好持久的抗菌效果。HE染色結(jié)果顯示，TiO2組炎癥細(xì)胞浸潤較少，與細(xì)菌計數(shù)結(jié)果較吻合。MO組也出現(xiàn)骨質(zhì)破壞局部區(qū)域，但TG組無此變化。由于過度的炎癥反應(yīng)和骨質(zhì)破壞，螺釘松動引起的細(xì)菌侵入的高風(fēng)險造成釘?shù)栏腥镜膼盒匝h(huán)，最終導(dǎo)致螺釘不穩(wěn)定，造成骨折端的活動，影響骨折的愈合。
與其他材料不同，TiO2涂層的螺釘僅僅在螺釘穿過皮膚的表面光催化起到殺菌作用，這些區(qū)域也恰好是細(xì)菌侵入機體造成釘?shù)栏腥旧踔凉撬柩椎摹伴T戶”?？股赝繉蛹般y涂層在整個螺釘所有區(qū)域都發(fā)揮殺菌作用，這也是造成細(xì)菌對銀離子及局部應(yīng)用抗生素耐藥的原因[12]；而在本實驗設(shè)計中，螺釘僅在可見光覆蓋的皮膚表面發(fā)揮作用，且TiO2只作為催化生成自由基的媒介本身并不消耗，不僅保證了長期應(yīng)用的殺菌效果，更避免了耐藥菌株及局部富集各類離子或抗生素所造成的機體毒性，有可能解決抗生素耐藥的難題。當(dāng)然，釘?shù)栏腥镜陌l(fā)生同樣受到機體免疫力、合并糖尿病與否、創(chuàng)傷初期局部組織皮膚條件等因素的制約，都有待于進一步研究。
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隨著新一代材料的問世及對微生物致炎機制理解的加深，研究[4-5]證實二氧化鈦(TiO2)的光催化特性可有效抑制細(xì)菌增殖，并且此類特性已被廣泛地應(yīng)用于水質(zhì)、土壤和空氣凈化、自清潔等多種領(lǐng)域。本實驗旨在采用陽極氧化技術(shù)制作TiO2涂層鈦螺釘，通過建立兔脛骨骨折合并金黃色葡萄球菌感染模型，對比觀察術(shù)后兔感染、日?；顒拥纫话闱闆r，定期進行影像學(xué)檢查，通過HE染色、細(xì)菌培養(yǎng)等檢查，評價TiO2涂層外固定支架鈦螺釘?shù)目咕Ч?/p>
1 材料與方法
1.1 TiO2涂層螺釘?shù)闹苽?采用陽極氧化法制備TiO2涂層。經(jīng)過拋光和超聲波清洗后，采用含有0.3wt%NH4F和2vol%H2O的乙二醇電解液，采用陽極氧化法制作TiO2涂層，陽極氧化時間控制在3.5～4 h。通過X射線衍射分析(ESCA5800，ULVAC-PHI，Chigasaki，日本)和掃描電鏡(日本日立S-4800，東京，日本)分別評價TiO2涂層的純度和厚度。
1.2 TiO2涂層螺釘體外抑菌實驗 取普通鈦螺釘和經(jīng)陽極氧化處理過的TiO2涂層螺釘各5枚進行抑菌實驗，分為普通螺釘組(TS組)和TiO2涂層組(TC組)。將螺釘進行常規(guī)高溫高壓滅菌后放置在已接種金黃色葡萄球菌菌株(金黃色葡萄球菌 ATCC25920，中原生物)的固體培養(yǎng)基中。整個操作過程中在超凈臺下完成，避免雜菌污染。將固體培養(yǎng)基放置恒溫箱(37℃)中孵化(加常規(guī)光照)，10 h后觀察抑菌圈直徑。
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1.5 細(xì)菌培養(yǎng)和計數(shù) 術(shù)后1 d、1周及4周時，TG組和MO組分別隨機處死兔子5只，拔除外固定架后，迅速將無菌棉簽插入脛骨干骺端螺釘釘?shù)纼?nèi)，5 min后取出放入25 mL 0.85%氯化鈉溶液的離心管中，放入均質(zhì)器(8 000 r/min處理2 min)混勻。然后通過Baird-Parker平板計數(shù)法進行細(xì)菌計數(shù)，將1/10、1/100和1/1 000的稀釋液接種到Baird-Parker瓊脂平板中，置于37 ℃恒溫箱中16 h，計算細(xì)菌數(shù)量。
1.6 影像學(xué)檢查 術(shù)后1 d、1周、4周末行脛骨X線檢查，對比骨折端對位情況，觀察骨折端骨痂生長情況，判斷骨折端愈合的差異。
1.7 組織學(xué)評估(HE染色) 術(shù)后1 d、1周、4周末取釘?shù)乐車浗M織和骨組織進行石蠟包埋固定，HE染色。HE染色病理切片平面與釘?shù)垒S線平行且經(jīng)過釘?shù)肋吘?，以便于由淺及深觀察釘?shù)乐車浗M織感染以及骨組織炎性浸潤情況。
1.8 統(tǒng)計學(xué)方法 采用t(或t′)檢驗。
2 結(jié)果
2.1 TiO2涂層螺釘?shù)闹谱骷肮獯呋志鷮嶒?能譜分析表明，氧原子與鈦原子的摩爾比約為2∶1，在鈦螺釘表面形成的材料是TiO2。掃描電子顯微鏡測量顯示氧化產(chǎn)生的TiO2膜均勻，膜厚約為2 μm(見圖2)。
2.2 TiO2涂層螺釘體外光催化抑菌實驗結(jié)果 10 h后瓊脂培養(yǎng)基菌落開始形成(見圖3A、圖3B)。TiO2涂層螺釘周圍可見明顯抑菌圈，而普通螺釘未見明顯抑菌圈。TC組的抑菌圈半徑(測量抑菌圈半徑，以螺釘中央為點，垂直于螺釘軸分別測量螺釘中央距離兩側(cè)抑菌圈的距離)較TS組大[(2.96±2.86)cm vs (33.96±6.10)cm，t=10.29,P<0.01],TiO2涂層螺釘在可見光照下較普通鈦螺釘能夠明顯抑菌。
2.3 釘?shù)儡浗M織炎性程度 術(shù)后1 d、1周和4周軟組織炎性程度評分MO組均高于TG組(P<0.05～P<0.01)(見表2)。
表2 2組釘?shù)栏腥拒浗M織外觀評分比較分)
2.4 細(xì)菌培養(yǎng)和計數(shù)結(jié)果 術(shù)后1 d細(xì)菌數(shù)(對數(shù)值)2組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。術(shù)后1周和術(shù)后4周，TG組細(xì)菌數(shù)量(對數(shù)值)均較MO組下降(P<0.01)(見表3)。
表3 2組釘?shù)婪置谖锛?xì)菌培養(yǎng)計數(shù)比較
2.5 影像學(xué)檢查結(jié)果 脛骨X線攝片結(jié)果顯示，術(shù)后1周時TG組(見圖4A)較MO組(見圖4B)對位好，且骨痂量較MO組多，TG組1周時骨折線開始模糊，而MO組骨折線仍較清晰。4周時，TG組(見圖4C)骨折端已到達骨性愈合，骨折端對位對線可；MO組(見圖4D)骨折端位移仍較明顯，骨折線已模糊，但骨髓腔尚未相通，未達到骨性愈合。
2.6 HE染色結(jié)果 MO組在術(shù)后1 d時軟組織HE染色可見大量中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞及漿細(xì)胞浸潤；1周時炎性細(xì)胞浸潤更明顯，局部可見灶狀壞死；4周時釘?shù)纼?nèi)可見大量滲出物，纖維組織增生和灶狀壞死并存。而TG組軟組織HE染色則僅在釘?shù)乐車娚倭垦仔约?xì)胞浸潤(見圖5)。骨組織的HE染色，MO組術(shù)后1 d、1周、4周均表現(xiàn)為釘?shù)纼?nèi)大量炎性細(xì)胞浸潤，部分骨組織螺紋破壞吸收；而TG組則表現(xiàn)為釘?shù)缆菁y清晰無破壞及吸收現(xiàn)象，釘?shù)纼?nèi)炎性細(xì)胞滲出較少(見圖6)。
3 討論
大量實驗[7-9]表明，TiO2可以在可見光紫外線波段下產(chǎn)生氧自由基，從而抑制細(xì)菌的增殖和黏附?？梢酝茰y，TiO2的光催化抗菌特性可能用于防止釘?shù)栏腥?。在紫外光下，TiO2材料可以產(chǎn)生具有強大氧化還原能力的電子空穴對，該電子空穴繼而與周圍的水及氧氣產(chǎn)生活性氧類等一系列羥基基團結(jié)合，短時間內(nèi)達到去污和殺菌的目的。ZUCCHERI等[10]則通過實驗證實，雖然紫外光只占日光總量的4%左右，但是可見光中的紫外部分就足以被TiO2利用借以催化殺菌，而涂層的納米程度則可增加光催化的效率。本實驗中，我們用陽極氧化法制作的TiO2涂層螺釘在可見光下顯示出明顯地抑菌效果。一般來說，螺釘周圍的皮膚是防止微生物入侵的第一道重要防線。我們的研究揭示了TiO2涂層螺釘可以有效的預(yù)防釘?shù)栏腥?，且有持續(xù)的抗菌效果。KOSEKI等[11]研究發(fā)現(xiàn)，TiO2涂層螺釘?shù)墓獯呋匦栽诖笫竽Ｐ椭芯哂辛己玫男Ч哂酗@著的抑菌能力(76.7%抑制)。本文結(jié)果發(fā)現(xiàn)術(shù)后1 d，TG組的細(xì)菌數(shù)就少于MO組，而且在第1周和第4周，TG組細(xì)菌數(shù)則明顯少于MO組，顯示TiO2涂層螺釘良好持久的抗菌效果。HE染色結(jié)果顯示，TiO2組炎癥細(xì)胞浸潤較少，與細(xì)菌計數(shù)結(jié)果較吻合。MO組也出現(xiàn)骨質(zhì)破壞局部區(qū)域，但TG組無此變化。由于過度的炎癥反應(yīng)和骨質(zhì)破壞，螺釘松動引起的細(xì)菌侵入的高風(fēng)險造成釘?shù)栏腥镜膼盒匝h(huán)，最終導(dǎo)致螺釘不穩(wěn)定，造成骨折端的活動，影響骨折的愈合。
與其他材料不同，TiO2涂層的螺釘僅僅在螺釘穿過皮膚的表面光催化起到殺菌作用，這些區(qū)域也恰好是細(xì)菌侵入機體造成釘?shù)栏腥旧踔凉撬柩椎摹伴T戶”?？股赝繉蛹般y涂層在整個螺釘所有區(qū)域都發(fā)揮殺菌作用，這也是造成細(xì)菌對銀離子及局部應(yīng)用抗生素耐藥的原因[12]；而在本實驗設(shè)計中，螺釘僅在可見光覆蓋的皮膚表面發(fā)揮作用，且TiO2只作為催化生成自由基的媒介本身并不消耗，不僅保證了長期應(yīng)用的殺菌效果，更避免了耐藥菌株及局部富集各類離子或抗生素所造成的機體毒性，有可能解決抗生素耐藥的難題。當(dāng)然，釘?shù)栏腥镜陌l(fā)生同樣受到機體免疫力、合并糖尿病與否、創(chuàng)傷初期局部組織皮膚條件等因素的制約，都有待于進一步研究。
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