蔡 瑤，高 涌，余朝文

隨著社會工業(yè)化、城市化的加速，動脈粥樣硬化引起的心腦及外周血管疾病已成為全球人類第一大殺手[1]。在動脈血管內(nèi)發(fā)生的一系列炎癥反應(yīng)，會導(dǎo)致血管內(nèi)皮的增厚、管腔的狹窄，甚至是完全閉塞[1-2]。研究[3-4]表明，存在于骨髓和外周血中的內(nèi)皮前體細(xì)胞 (endothelial progenitor cells，EPCs)在損傷血管的修復(fù)與重塑中起到了重要的作用。Periostin蛋白又名骨膜蛋白，是細(xì)胞外基質(zhì)蛋白家族的一種[5]。有研究[5-7]報道，Periostin蛋白對于惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移以及瘤體血管的建立起著重要作用；而用特異性抗體阻斷蛋白的表達(dá)，將會導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞遷移能力的改變。本實(shí)驗(yàn)通過分離、培養(yǎng)和鑒定小鼠EPCs，采用CCK-8法、劃痕法、Transwell小室法和流式細(xì)胞儀檢測等方法，探討Periostin蛋白過表達(dá)對EPCs生物學(xué)功能的影響，以期為后期深入研究過表達(dá)Periostin蛋白的EPCs體內(nèi)實(shí)驗(yàn)和調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及材料 DMEM培養(yǎng)基(Gibco公司)，內(nèi)皮前體細(xì)胞分離試劑盒及F液(天津?yàn)笊?，多聚甲醛(國藥集團(tuán))，結(jié)晶紫染色液(國藥集團(tuán))，熒光(Cy3)標(biāo)記羊抗兔 IgG (武漢博士德生物工程有限公司)，CD34(種屬：兔)抗體(Abcam公司)，寡核苷酸Oligos、慢病毒載體質(zhì)粒Lentivirus5及測序(吉瑪基因公司)，Matrigel Basement Membrane Matrix(BD公司)，Mouse ELISA Kit(ab193727 Periostin)，Trypsin-EDTA Solution(Hyclone公司)，多標(biāo)記微孔板檢測儀(PerkinElmer EnSpire公司)，CCK-8試劑盒(DOJINDO公司)，Transwell小室(Corning公司)。

1.2 方法

1.2.1 小鼠EPCs分離、培養(yǎng)和鑒定 取20只C57BL/6小鼠(昆明醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供)，雌雄不拘，4～5周齡，體質(zhì)量 18～20 g，飼養(yǎng)于恒溫18～20 ℃和恒濕50%～80%條件的SPF級動物實(shí)驗(yàn)室，自由攝取標(biāo)準(zhǔn)飼料與無菌水，EPCs的分離、培養(yǎng)及免疫熒光的鑒定參照文獻(xiàn)[8-9]進(jìn)行。

1.2.2 目的基因調(diào)取、PCR擴(kuò)增 通過美國國立生物技術(shù)信息中心(NCBI，National Center for Biotechnology Information)查找小鼠Periostin 基因序列信息，ID：50706；Periostin基因長度：2 436 bp。Oligo設(shè)計，Periostin基因目的基因上下游引物分別加上NotⅠ和BamHⅠ及保護(hù)堿基，將 Oligo溶解成50 μmL后，分別取相同體積至1.5 mL離心管，混合均勻，配成Oligo混合液；用配置好的Oligo混合液行第一輪PCR反應(yīng)；用Oligo-1和Oligo-64進(jìn)行第二輪PCR反應(yīng)，模板為第一輪PCR反應(yīng)的產(chǎn)物；再用第一輪的PCR產(chǎn)物為模板，通過第二輪PCR則可獲得單一的目的基因條帶。PCR反應(yīng)完成后，利用Agarose電泳并切膠回收基因片段。

1.2.3 載體的構(gòu)建及測序驗(yàn)證 用NotⅠ和BamHⅠ對Periostin基因片段慢病毒載體LV5進(jìn)行酶切，T4 DNA連接雙酶切得到的Periostin基因片段和線性化的載體(見圖1)，用氯化鈣法制備感受態(tài)細(xì)胞，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，取200 μL陽性克隆對應(yīng)的菌液送測序，并將剩余的菌液用甘油保存；將測序結(jié)果與目的基因序列進(jìn)行對比，正確無誤后，用保存的甘油菌液接菌LB培養(yǎng)基，進(jìn)行大量質(zhì)粒抽提，得到足夠的重組質(zhì)粒。

1.2.4 慢病毒侵染 取出培養(yǎng)的細(xì)胞，鏡下確認(rèn)EPCs生長狀態(tài)良好，經(jīng)過消化酶消化后重懸，提取適量細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板中，放置于37 ℃、5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)過夜；取慢病毒培養(yǎng)液(Lentivirus-NC病毒液)與細(xì)胞共培養(yǎng)24 h；將其放置在熒光倒置顯微鏡下觀察。

1.2.5 Western blotting檢測目的蛋白表達(dá) 將目的細(xì)胞總蛋白轉(zhuǎn)置PVDF膜上，置于含Periostin鼠單抗(1∶500)的封閉液中，4 ℃，24 h后同辣根過氧化物酶標(biāo)記的相應(yīng)二抗(1∶600)共同孵育(室溫)1.5 h，并與化學(xué)發(fā)光底物結(jié)合5 min。β-actin作內(nèi)參。

1.2.6 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計分為過表達(dá)慢病毒組、陰性對照組和空白對照組3組，將生長狀態(tài)良好的EPCs及其穩(wěn)篩株用消化酶消化后重懸，然后吸取適量細(xì)胞按照每組5個復(fù)孔，重復(fù)接種至96孔培養(yǎng)板中，37 ℃、5%CO2飽和濕度條件下的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，后向每孔中加入10 μL的CCK-8溶液，然后放在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1 h。孵育1h后用酶標(biāo)儀測定各組細(xì)胞在450 nm處的吸光度，記錄吸光度值，得到120 h細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1.2.7 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn) 在12孔培養(yǎng)板的背后用Marker筆劃3條水平直線，橫穿過孔。按照實(shí)驗(yàn)分組將狀態(tài)良好的EPCs及其穩(wěn)篩株消化后重懸，接種至12孔培養(yǎng)板中，接種原則為過夜后融合率達(dá)到80%以上。待細(xì)胞貼壁后，用槍頭在每個孔中劃2～3條垂直直線，與之前劃的直線成垂直關(guān)系。更換新鮮無血清培養(yǎng)基，選取3個點(diǎn)拍照。拍照后于37 ℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。24 h后拍照記錄。

1.2.8 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn) 將凍存的Matrige稀釋成1 mg/mL。取適量稀釋的Matrigel鋪于Transwell小室聚碳酸酯膜上，放置在37 ℃條件下1 h，等待Matrigel聚合成凝膠狀態(tài)。再向每孔中加入200 μL DMEM液體培養(yǎng)基，使膠重構(gòu)。將20% FBS培養(yǎng)基600 μL加入Transwell下室中。按照實(shí)驗(yàn)分組將狀態(tài)良好的EPCs及其穩(wěn)篩株消化后重懸，在上室孔中加入適量細(xì)胞，37 ℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。加入適量4%多聚甲醛，固定細(xì)胞30 min，加入適量結(jié)晶紫染色液，染色30 min；用適量PBS反復(fù)清洗小室，去除多余的結(jié)晶紫染色液；在倒置顯微鏡下觀察拍照，每組3張照片。

1.2.9 細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn) 按照實(shí)驗(yàn)分組將狀態(tài)良好的EPCs及其穩(wěn)篩株消化后重懸，取適量細(xì)胞接種至6孔板中。24 h后用Trypsin-EDTA free消化重懸細(xì)胞。加入400 μL 1×Binding Buffer懸浮細(xì)胞。將懸浮的細(xì)胞中加入5 μL AnnexinV-FITC，對其輕輕的混勻后放置于4 ℃避光條件下孵育15 min。再向細(xì)胞懸液中加入10 μL PI，再次混勻后置于4 ℃避光條件下孵育5 min。在1 h內(nèi)，用Accuri C6 個人型流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞凋亡的情況。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用方差分析和q檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 EPCs分離、培養(yǎng)和鑒定 EPCs在EGM-2培養(yǎng)基中呈“克隆樣”生長，3～5 d后細(xì)胞融合度超過80%。原代培養(yǎng) 7～10 d與第1代培養(yǎng)2～3 d的EPCs呈“鋪路石”樣生長，少部分呈梭形和多邊形，細(xì)胞CD34免疫熒光鑒定中紅色熒光為抗原陽性，陽性率>90%，Hoechst染色呈藍(lán)色，Merge染色呈混合色(見圖2)。

2.2 目的基因的獲取及載體的構(gòu)建 Agarose電泳結(jié)果顯示成功獲取了目的基因(見圖3)。且攜帶目的基因的LV5/Periostin基因重組慢病毒載體構(gòu)建成功。

2.3 EPCs的慢病毒侵染 結(jié)果顯示，未經(jīng)侵染的EPCs不表達(dá)綠色熒光蛋白(GFP)，經(jīng)重組慢病毒LV5/Periostin侵染的 EPCs，熒光倒置顯微鏡下可見亮綠色GFP表達(dá)(見圖4)。

2.5 感染株目的蛋白的表達(dá) Western blotting檢測顯示，與陰性對照組EPCs相比，過表達(dá)慢病毒組Periostin蛋白表達(dá)顯著增高(P<0.05)(見表1、圖5)。

2.6 細(xì)胞增殖、遷移、侵襲及凋亡實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，過表達(dá)慢病毒組細(xì)胞在培養(yǎng)120 h后細(xì)胞增殖活性顯著低于陰性對照組(P<0.05)，而陰性對照組與空白對照組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。在同一重復(fù)實(shí)驗(yàn)中過表達(dá)慢病毒組細(xì)胞遷移率、侵襲細(xì)胞數(shù)及凋亡細(xì)胞數(shù)均顯著大于陰性對照組(P<0.05)，且陰性對照組細(xì)胞遷移率、侵襲細(xì)胞數(shù)顯著及凋亡細(xì)胞數(shù)均大于空白對照組(P<0.05)(見表2、圖6～8)。

表1 3組EPCs表達(dá) Periostin目的蛋白的Western blotting灰度分析

表2 Periostin目的蛋白過表達(dá)對EPCs增殖影響的CCK-8檢測分析

3 討論

成熟的血管內(nèi)皮細(xì)胞(endothelial cells，ECs)的增殖、遷移和重塑是血管發(fā)生和生成的基礎(chǔ)，當(dāng)血管發(fā)生損傷后，功能性ECs增殖是血管損傷后重建的關(guān)鍵[10]。EPCs是成熟ECs的前體細(xì)胞，其增殖、分化能力旺盛，可趨化到血管新生部位并分化為成熟的ECs[3-4]。骨髓和其他一些器官的EPCs通過向遠(yuǎn)處血管損傷處遷移，并分化成熟，取代衰老和損傷的內(nèi)皮細(xì)胞。這一發(fā)現(xiàn)為臨床治療血管損傷、動脈粥樣硬化等各種缺血性疾病指明了新的方向。

Periostin蛋白又稱骨膜細(xì)胞相關(guān)蛋白，是一種細(xì)胞外基質(zhì)N-糖蛋白[5]，該種蛋白參與細(xì)胞增殖、腫瘤的發(fā)生發(fā)展和炎癥反應(yīng)等過程。其中，在腫瘤組織中，Periostin蛋白的高表達(dá)，通過MAPK、Akt等通路使上皮細(xì)胞發(fā)生表型改變[11-12]，從而使得內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生遷移活性的改變，而沉默該蛋白表達(dá)基因則顯著影響細(xì)胞遷移的潛力。許多試驗(yàn)[13-14]研究提示，運(yùn)用RNA重組轉(zhuǎn)染或干擾技術(shù)，上調(diào)或是降低該蛋白基因的表達(dá)，可以顯著影響腫瘤組織血管的發(fā)生。而Periostin蛋白在血管內(nèi)皮前體細(xì)胞中亦表達(dá)。但有研究[15]指出，該蛋白在正常人體組織和生理過程中表達(dá)水平很低，且該種蛋白過表達(dá)體系對EPCs增殖、遷移和凋亡等生物學(xué)功能產(chǎn)生何種影響尚沒有明確的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

在本研究中，我們成功地從小鼠骨髓獲得大量的EPCs，并證實(shí)EPCs表達(dá)干細(xì)胞標(biāo)志CD34。對于EPCs的培養(yǎng)和鑒定，尚沒有形成統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)。在EPCs表型的鑒定上，沒有發(fā)現(xiàn)該細(xì)胞表達(dá)特異且唯一的表面標(biāo)記。被最早發(fā)現(xiàn)的EPCs表面標(biāo)記是CD34，證明了EPCs是造血干細(xì)胞來源。但是隨著細(xì)胞向成熟的分化，CD34表達(dá)水平逐漸下降，而CD133表達(dá)則有著一個先上升后下降的趨勢。同時，ECs表面抗原CD31、vWF和Flk-1等表達(dá)升高[16]。

我們還發(fā)現(xiàn)，單純上調(diào)Periostin蛋白基因表達(dá)對細(xì)胞增殖無明顯影響，甚至促進(jìn)細(xì)胞的凋亡，這與我們預(yù)期的實(shí)驗(yàn)結(jié)果有一定不符。但是從細(xì)胞遷移、侵襲功能方面看，實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以明確提示，Periostin蛋白基因的過表達(dá)，能夠顯著提高細(xì)胞遷移和侵襲的能力，這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果也可為后期的EPCs體內(nèi)治療提供了可能。