楊 琳

(池州市環(huán)境保護(hù)監(jiān)測站，安徽 池州 247000)

1 前 言

葉綠素a是水生態(tài)調(diào)查中必不可少的調(diào)查項目，是反映浮游植物生物量乃至水體富營養(yǎng)化程度的最直接有效的指標(biāo)[1]。浮游植物長期以來就被用作水質(zhì)的生物指標(biāo)，特別對湖庫而言，測定浮游植物的物種和數(shù)量，對水質(zhì)評價有著更為重要的實用意義，而葉綠素a是現(xiàn)場觀測中必不可少的測量參數(shù)[2]。目前，浮游植物葉綠素a的監(jiān)測方法主要有分光光度法、熒光法、色譜法，其中傳統(tǒng)的分光光度法因所需儀器價格較低、操作簡單、測定結(jié)果穩(wěn)定，因此應(yīng)用最為廣泛。不過，由于不同研究對于葉綠素a測定要求時限和精度要求不同，采用研究方法也有所差異，此外，由于當(dāng)前研究方法眾多，往往給研究者在方法選擇方面帶來困惑，因此，本文將重點對浮游植物葉綠素a監(jiān)測方法進(jìn)行綜述以為今后相關(guān)研究工作提供借鑒和參考。

2 國內(nèi)外研究進(jìn)展

目前，國內(nèi)外葉綠素a測定方法主要有分光光度法、熒光法、高效液相色譜法以及遙感影像法等。現(xiàn)對各種方法綜述如下。

2.1 分光光度法

葉綠素a的最大吸收峰位于663nm，根據(jù)Lambert Beer 定律，在一定濃度的范圍內(nèi)，葉綠素a吸光度值與其濃度成正比。水樣經(jīng)過濾濃縮、提取、定容后，在最大吸收波長下進(jìn)行測定其吸光度值，去除干擾值，再根據(jù)葉綠素a 的標(biāo)準(zhǔn)曲線就能計算出葉綠素a 的濃度。目前，測定葉綠素一般較多采用分光光度法來進(jìn)行準(zhǔn)確的定量，分光光度法是基于物質(zhì)分子對光具有選擇吸收的特性而建立起來的分析方法，屬于光度法的一種[3]。國內(nèi)水體浮游植物葉綠素測定方法常用的是《水和廢水監(jiān)測分析方法》(第四版)[4]推薦的分光光度法。

1999年，汪志國等用雙波長分光光度法同時測定葉綠素a，該法不進(jìn)行預(yù)分離，操作簡便，結(jié)果與先分離、再以強(qiáng)氧化劑消解后分別測定鎂離子濃度進(jìn)而推算葉綠素a濃度，與原子吸收法具有較好的相關(guān)關(guān)系[5]。

2005年，韓桂春等[6]對葉綠素測定的國標(biāo)法、金相燦和屠清瑛主編的《湖泊富營養(yǎng)化調(diào)查規(guī)范》(第二版)中葉綠素a 測定方法與改進(jìn)后的第二種方法進(jìn)行了比較。比較而言，前兩種方法樣品處理方法繁瑣，研磨使用的丙酮有毒，研磨樣品轉(zhuǎn)移的時候會造成損失。第二種方法的加酸量不容易掌握，并且酸化后還需穩(wěn)定 15min，不適宜進(jìn)行大批量監(jiān)測。論文提出將濾膜直接放入帶塞的試管中，加入10 mL 90%丙酮直接浸提。這種方法葉綠素a 浸提完全沒有損失，而且具有操作簡便、準(zhǔn)確等種種優(yōu)點。

2008年，馮菁等采用8種不同方法提取微囊藻樣品，并且對提取液分別采用三色法、單色法測定吸光度，結(jié)果顯示單色法的變異系數(shù)普遍稍大于三色法，即從方法的穩(wěn)定性來說，三色法稍優(yōu)于單色法；從方法的適用范圍來講，三色法基本上適用于各種溶劑，而單色法僅適用于丙酮提取液。另外，從方法的簡便性來說，三色法操作簡單，產(chǎn)生誤差幾率小，耗時比單色法短。因此，Chl-a的測定可以根據(jù)實際情況的要求選取[7]。

2012 年，童桂鳳等[8]將《水和廢水監(jiān)測分析方法》(第四版)和 ISO 10260∶1992(E)中測定葉綠素 a 的典型方法作了比較，比較結(jié)果表明，兩種方法的測定結(jié)果不僅存在顯著性的差異，而且具有一定的相關(guān)性，他們從提取方法、提取溶劑和計算公式等方面討論了原因，指出ISO方法提取效率更高，操作更簡便。

2017年，李會玲等對《水和廢水監(jiān)測分析方法》(第四版)[4]書中葉綠素a測定方法進(jìn)行了簡化改進(jìn)，提高了葉綠素a的提取率和穩(wěn)定性，確保了實驗結(jié)果的準(zhǔn)確度[9]。

現(xiàn)行的分光光度法按照提取劑不同主要分為丙酮法、乙醇法等，其中，丙酮法由于丙酮毒性較大，目前使用較少，乙醇法使用逐漸增多。按照測定方法不同分為單色法和三色法。分光光度法作為浮游植物葉綠素a常規(guī)測定方法，多應(yīng)用于科研工作和環(huán)保地表水例行監(jiān)測，適合室內(nèi)大批量水環(huán)境樣品測定。為提高該方法測定準(zhǔn)確度，分光光度法可以從以下幾個方面進(jìn)行完善：改變細(xì)胞破碎的方式，如超聲波、反復(fù)融凍；選擇更好的萃取試劑，如混合試劑；優(yōu)化提取方法，如延時或加熱提??；選擇更優(yōu)質(zhì)的濾膜，如玻璃纖維濾膜，冷凍避光保存等。

2.2 熒光法

熒光現(xiàn)象是指物質(zhì)在吸收波長比較短并且其能量較高的光以后，把光能轉(zhuǎn)換成可見光，即波長比較長的光的現(xiàn)象叫做熒光現(xiàn)象。由于檢測的熒光物質(zhì)有所不同，所以吸收光譜也就不同，熒光的光譜特性因而也有所不同。因此，可以根據(jù)熒光光譜的特點來區(qū)分熒光物質(zhì)的性質(zhì)[3]。當(dāng)葉綠素a的分子吸收了光量子，這樣就得到能量，之后便從基態(tài)躍遷到了激發(fā)態(tài)，躍遷到激發(fā)態(tài)便產(chǎn)生熒光，再用熒光光度計來測量植物體內(nèi)所含葉綠素a的熒光強(qiáng)度，進(jìn)而確定葉綠素a的含量[10-11]。

國外應(yīng)用熒光法測定浮游植物葉綠素a起步較早，并且在實際應(yīng)用中取得了大量的實踐經(jīng)驗。

1973年，H.H.Kim首次利用機(jī)載激光熒光計實現(xiàn)了海藻濃度及其分布的原位測量。該系統(tǒng)采用脈沖燃料激光器作為激發(fā)光源，通過測量海水表層葉綠素a所發(fā)出的熒光強(qiáng)度，獲得有關(guān)海藻分布的信息，能夠探測到mg/m3量級的葉綠素a含量。之后，基于激光誘導(dǎo)熒光和Raman散射機(jī)理的機(jī)載和船載激光雷達(dá)遙測系統(tǒng)引起了人們極大興趣，后續(xù)出現(xiàn)了大量相關(guān)研究報道[12]。

1979年，Yentsch首次提出采用光譜熒光信號探測藻類群落結(jié)構(gòu)，但是熒光法結(jié)果不夠穩(wěn)定，雖然通過用DCMU處理浮游植物分子能部分抑制熒光的變化，但很難自動地分析藻類群落的結(jié)構(gòu)。此后，熒光法更多的應(yīng)用于單一藻類培養(yǎng)物的測定分析和的監(jiān)測[12]。

1994年，Kaitala 等發(fā)現(xiàn)輔助色素與葉綠素的熒光比值不隨生長時期的變化而變化，可以通過“選擇激發(fā)浮游植物色素”來分析浮游植物群落的色素組成[13]。先在實驗室建立重要浮游藻純種的光譜特征分類方法，通過天然水體光譜與純種光譜基本特征的比較分析，繼而得到天然水體色素組成，進(jìn)一步對浮游藻分類。只能對實驗室中已經(jīng)建立純種藻類光譜特性的藻種進(jìn)行區(qū)分局限性大，需要消耗大量的人力和物力。

1995年，Lee等發(fā)現(xiàn)藍(lán)藻可以敏感而有選擇性地從混合浮游植物中檢測通過藻藍(lán)蛋白，激發(fā)波長620 nm和葉綠素激發(fā)波長440 nm，前者用于檢測自身的藍(lán)細(xì)菌，后者是為減去真核藻類存在于樣品中的干涉[14]。根據(jù)藍(lán)藻所具有的藻藍(lán)蛋白發(fā)出的特征熒光譜，建立了現(xiàn)場活體監(jiān)測藍(lán)藻葉綠素質(zhì)量濃度的熒光分析技術(shù)，在 0.01～10μg/mL的范圍內(nèi)可準(zhǔn)確測定海水樣品的藍(lán)藻葉綠素質(zhì)量濃度。研究了淡水中藍(lán)藻進(jìn)行了定性和定量的分析，用葉綠素的濃度值來反映藍(lán)藻的生物量，并不能真正意義上說明藍(lán)藻的數(shù)量。

1997年，D. Mckee等報道了一種新型的能同時測量葉綠素?zé)晒?、光線衰減及大角度散射的組合式儀器[15]。

該儀器包括三個光學(xué)傳感器(熒光計、濁度計和渾濁度儀)以及配套子系統(tǒng)包括微處理單元、數(shù)據(jù)存儲單元和能量供給單元，并且全部密封在不銹鋼管殼內(nèi)，能潛入水中工作。三個光學(xué)傳感器共用一個脈沖氙燈作光源。在蘇格蘭西海岸進(jìn)行的現(xiàn)場試驗表明，該組合儀器具有良好的線性關(guān)系、較高的分辨率和較大的動態(tài)范圍。

2002年，M.Beutler等人研制出了多波長激發(fā)熒光的葉綠素濃度現(xiàn)場測量儀，整個儀器置于放入水中的圓筒內(nèi)，能在幾秒鐘的時間內(nèi)對種藻類葉綠素濃度分別進(jìn)行測量，并把測量結(jié)果與測得的結(jié)果進(jìn)行比較,實驗證明這種方法是有效的[16]。

國內(nèi)應(yīng)用熒光法對水體浮游植物進(jìn)行監(jiān)測的研究始于80年代末[17]。國家海洋局第二海洋研究所于1989年應(yīng)用熒光高度成像光譜儀測的葉綠素 a 濃度值與現(xiàn)場船測結(jié)果以及美國空間中心的機(jī)載海洋激光雷達(dá)所測結(jié)果具有良好的相關(guān)關(guān)系[18]。

1996年，中國科學(xué)院海洋研究所報道了一種適用于各種船只的海水葉綠素含量走航自動測定系統(tǒng)[19]。其設(shè)計方案是：用水泵從船底連續(xù)汲取海水，現(xiàn)場海水連續(xù)和穩(wěn)定地進(jìn)入熒光光度計樣品室，測定海水中浮游植物活體細(xì)胞的熒光強(qiáng)度，測定結(jié)果經(jīng)模數(shù)轉(zhuǎn)換由主計算機(jī)記錄。

1998年，燕山大學(xué)的王玉田教授團(tuán)隊基于葉綠素a的熒光特性，論證了海藻葉綠素a與海藻濃度之間的相關(guān)性，用于海藻生物量測量[20]。

2004年，唐堯基等[21]用N,N-二甲基甲酰胺作為萃取劑，利用熒光法激發(fā)與發(fā)射波長之差為 237nm，建立了同步熒光法測定海水中葉綠素 a 含量的新方法。該方法具有快速、靈敏及其他常見色素不干擾測定的優(yōu)點。同年，J. Gregor等[22]對標(biāo)準(zhǔn) ISO葉綠素 a 定量方法、熒光光譜測定法和水下熒光探針在現(xiàn)場對浮游植物進(jìn)行定量測定的方法在淡水環(huán)境中的性能進(jìn)行了比較。實驗發(fā)現(xiàn)水下熒光探針靈敏高效，適合現(xiàn)場測定。

2012 年，馬永山等[23]建立了對葉綠素 a 的導(dǎo)數(shù)同步熒光檢測法。這種方法簡便快速，而且并不需要進(jìn)行復(fù)雜的前處理。因此得出，葉綠素 a 的線性范圍是0.02～125μg/L，其檢出限是 0.25μg/L，其回收率是 97.0%～103.8%。同年，董大圣等[24]研究了葉綠素 a 和濁度傳感器技術(shù)及其設(shè)計。該傳感器技術(shù)基于熒光誘導(dǎo)的葉綠素 a檢測原理和散射的濁度檢測技術(shù)原理進(jìn)行設(shè)計，可以實時測量海水的相關(guān)參數(shù)，實現(xiàn)設(shè)計所要求的微弱光信號檢測功能。

熒光法具有測定速度快、靈敏度高、實時性較好，不受其它常用色素干擾等優(yōu)點, 多應(yīng)用于現(xiàn)場測定，或者是在線監(jiān)測，特別是水體的富營養(yǎng)化測定，可以隨時且及時的監(jiān)測水體中浮游植物的生長分布以及其變化的狀態(tài)[3]。這一測定方法現(xiàn)行主要有普通熒光測定和同步熒光測定?？梢赃M(jìn)一步研發(fā)快速、準(zhǔn)確的現(xiàn)場熒光儀，確定最佳測定條件，豐富地表水原位測定手段。

2.3 色譜法

色譜法的原理是被分離物質(zhì)在流動相和固定相中的吸附力不同，當(dāng)樣品通過色譜柱的時候，被分離物質(zhì)在流動相和固定相中不斷地發(fā)生吸附、解吸，造成組分通過色譜柱的時間不同，不同的物質(zhì)會先后流出色譜柱，進(jìn)入到檢測器中進(jìn)行分析，從而達(dá)到分離的目的[3]。

在20世紀(jì)70、80年代薄層色譜分析發(fā)展的較為迅速，這使浮游植物的標(biāo)志色素可輕易分離，但是由于此項技術(shù)專業(yè)性太強(qiáng)、效率較低而沒有被廣泛應(yīng)用。Mantoura[25]、Suzuki和Wright[26]等很多學(xué)者相繼建立了分析海洋浮游植物光合色素組成的高效液相色譜法。

2005 年，林少君等[11]對比了葉綠素 a 提取的反復(fù)凍融-浸提法與標(biāo)準(zhǔn)方法中的研磨法，證實反復(fù)凍融法有穩(wěn)定性好、人為誤差小、結(jié)果準(zhǔn)確和操作簡單安全等優(yōu)點，非常適合運用于常規(guī)的水質(zhì)監(jiān)測。

2009 年，侯燕松等[27]學(xué)者采用反相高效液相色譜技術(shù)(RP2HPLC)系統(tǒng)的研究了我國主要的淡水藻類的光合色素，在8 種純培養(yǎng)藻類中共確定類胡蘿卜素、葉綠素及其衍生物 19 種。通過實際的監(jiān)測，證實了此項技術(shù)應(yīng)用的可行性，為基于HPLC分析技術(shù)的浮游植物化學(xué)分類法提供了重要理論依據(jù)。

2010年，程紅艷等[28]研發(fā)使用超聲波輔助快速提取 RP-HPLC測定滸苔中葉綠素 a 和 b 含量的方法, 樣品前處理簡便易操作、提取效率高; 在選定的色譜條件下, 葉綠素 a 和 b 分離度高, 方法重復(fù)性好、回收率高, 可作為滸苔中葉綠素 a 和 b 含量快速測定的有效方法。

色譜法彌補(bǔ)了分光光度法無法區(qū)分各種色素混合體的缺陷，尤其在湖泊(水庫)營養(yǎng)狀態(tài)分級測定時，可作為分光光度法的有力補(bǔ)充。這一測定方法現(xiàn)行主要有高效色譜法(HPLC)和反向高效色譜法，具有柱效高、分析速度快、精確程度高的特點。為完善該測定方法，今后需進(jìn)一步優(yōu)化色譜條件的選擇，探索不同光合因子在不同實驗體系下的變化趨勢，了解更具體的光譜特征，建立完善的實驗體系，總結(jié)常見光合色素的保留時間、吸收光譜、校正及影響因子等參數(shù)。

2.4 遙感影像法

水質(zhì)遙感技術(shù)研究是定量遙感技術(shù)研究的一個重要領(lǐng)域。水體中的葉綠素a含量的遙感監(jiān)測大多通過對水體反射光譜的特征與葉綠素a的濃度之間的關(guān)系進(jìn)行分析從而建立一個數(shù)學(xué)模型，然后應(yīng)用到遙感圖像上再進(jìn)行反演，進(jìn)而對大面積水域的葉綠素a的濃度進(jìn)行定量估算[3]。目前，水質(zhì)遙感反演模型構(gòu)建的方法主要有三種：分析方法、經(jīng)驗方法和半經(jīng)驗方法。其中，主要方法是基于傳統(tǒng)統(tǒng)計回歸模型的經(jīng)驗方法。

1989 年，國家海洋局第二海洋研究所根據(jù)具有不同葉綠素濃度的水體在藍(lán)綠譜段所輻射的光譜特征有所不同，通過采用比值法來監(jiān)測海面葉綠素的濃度以及分布情況[29]。

2009 年，劉建萍等[30]人選取神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)法及遙感指數(shù)法兩種反演方法，來建立葉綠素 a 與 MODIS波段之間的函數(shù)關(guān)系，并且從反演精度和反演能力兩個角度對兩種方法分別進(jìn)行了研究比較。

2012 年，韋玉春等[31]提出使用線性基線校正方法來削弱水體光譜中懸浮泥沙的貢獻(xiàn)。根據(jù)渾濁水體中懸浮物的光學(xué)性質(zhì)確定的光譜線性基線校正可以較好的提高葉綠素 a 濃度的反演精度，改進(jìn)反演模型的診斷性。

2018年，夏曉蕓等[32]本文利用實時遙感影像數(shù)據(jù)與實測數(shù)據(jù)建立了適用于反演大伙房水庫葉綠素a的線性回歸模型和最小二乘支持向量機(jī)模型。由于水體結(jié)構(gòu)復(fù)雜，影響水質(zhì)參數(shù)光學(xué)性質(zhì)的因素較多，非線性的最小二乘支持向量機(jī)模型的反演精度明顯高于簡單的線性回歸模型。

2018年，張明慧等[33]結(jié)合MODIS遙感影像及浮標(biāo)實測數(shù)據(jù)，采用“時間連續(xù)彌補(bǔ)空間稀疏”的建模策略，通過RF方法構(gòu)建合理的Chl-a濃度反演模型，使用均方根誤差(RMSE)、平均絕對百分比誤差(MAPE)和決定系數(shù)(R2)進(jìn)行精度評價，并與傳統(tǒng)的BR模型進(jìn)行對比。結(jié)果表明，RF反演模型穩(wěn)定可靠、精度較高，可彌補(bǔ)傳統(tǒng)水質(zhì)監(jiān)測無法提供空間連續(xù)、宏觀、大范圍參量信息分布的局限性。該研究提出了基于機(jī)器學(xué)習(xí)的MODIS時序Chl-a濃度遙感反演方法，可為福建近岸水環(huán)境連續(xù)、大范圍監(jiān)測提供技術(shù)支持。

遙感法具有綜合、客觀、便捷的特點，適用于大面積水體或者海洋水體的長期動態(tài)監(jiān)測，滿足預(yù)測預(yù)警的現(xiàn)實需求?？梢詫崿F(xiàn)對水華和水體富營養(yǎng)化的監(jiān)測及評價，實現(xiàn)區(qū)域尺度甚至全球尺度上對水體表層水質(zhì)參數(shù)的時空動態(tài)變化進(jìn)行監(jiān)測。接下來，可以進(jìn)一步研究如何克服氣象、水文等制約因素，研發(fā)高時間、高空間、高光譜的衛(wèi)星傳感器，優(yōu)化大氣校正算法以及現(xiàn)場測量和反演算法。

3 結(jié) 論

隨著社會的快速發(fā)展，水華藍(lán)藻問題越來越突出，成為威脅河海湖庫生態(tài)環(huán)境的關(guān)鍵要素。葉綠素a監(jiān)測作為評價河海湖庫富營養(yǎng)化水平及水生態(tài)健康的重要指標(biāo)，其監(jiān)測方式目前越來越受到環(huán)境監(jiān)管部門及相關(guān)科研機(jī)構(gòu)的重視。雖然目前已有多種監(jiān)測方式應(yīng)用于實踐，不過每一種監(jiān)測方法都存在一定的限制條件。因此，環(huán)保部門進(jìn)行例行監(jiān)測或者科研機(jī)構(gòu)進(jìn)行長期跟蹤監(jiān)測時要根據(jù)監(jiān)測對象的不同選擇合適的方法，甚至選擇幾種監(jiān)測方法結(jié)合的方式來進(jìn)行葉綠素a的測定，以為水環(huán)境管理和科研工作提供可靠的數(shù)據(jù)支撐。