朱海泉 劉子敏 孟祥圣 孫 曉 王黎明

(南京醫(yī)科大學連云港臨床醫(yī)學院急診外科，連云港 222002)

骨關(guān)節(jié)炎是最常見的慢性關(guān)節(jié)疾病，涉及炎癥和關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)改變，會出現(xiàn)疼痛甚至關(guān)節(jié)功能障礙[1]。全世界60歲以上的人中約有10%的男性和18%的女性患有骨關(guān)節(jié)炎。骨關(guān)節(jié)炎是造成世界范圍內(nèi)疼痛、殘疾和社會經(jīng)濟負擔的主要原因[2]。骨關(guān)節(jié)炎治療是醫(yī)療健康事業(yè)的重大課題，開發(fā)有效的骨關(guān)節(jié)炎治療方法迫在眉睫。草藥被運用于骨關(guān)節(jié)炎的治療已具有悠久的歷史[3,4]。川芎的根或根莖可作為天然草藥，在血管舒張、抗炎、抗凝血及自由基清除等方面發(fā)揮著積極作用[5]。川芎嗪(Ligustrazine)(化學結(jié)構(gòu)式見圖1)是川芎的主要活性物質(zhì)，屬于生物堿類化合物，存在多種藥理學活性，可改善腦缺血/再灌注損傷，酒精性肝損傷及心絞痛等[6-9]。川芎嗪在調(diào)節(jié)細胞凋亡和炎癥反應(yīng)方面起著重要作用[10]。本研究主要目的是通過LPS處理人膝關(guān)節(jié)軟骨細胞誘導骨關(guān)節(jié)炎，探索川芎嗪對LPS誘導的骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞凋亡和炎癥反應(yīng)的影響及其機制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗藥物 川芎嗪(貨號與規(guī)格：95162，100 mg)分析純、LPS(貨號與規(guī)格：L3012，10 mg)來源于Sigma公司。

1.1.2試劑 DMEM-F12培養(yǎng)基(貨號：11320-033)、胎牛血清(貨號：10099158)來源于Thermo Fisher公司;Hoechst33258染色試劑盒(貨號：C0003)、白細胞介素(Interleukin,IL)-6的ELISA檢測試劑盒(貨號：PI330)來源于Beyoptime公司；腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor α,TNF-α)的ELISA檢測試劑盒(貨號：69-98069)、一氧化氮(Nitric oxide,NO)的ELISA檢測試劑盒(貨號：69-20148)來源于MSK公司；抗II型膠原( collagen II)抗體(貨號：ab34712)、抗基質(zhì)金屬蛋白酶-13( Matrix metalloproteinase 13,MMP-13 )抗體(貨號：ab39012)、抗聚集蛋白聚糖(Aggrecan)抗體(貨號：ab3778)、抗NF-κB P65抗體(貨號：ab207297)、抗p-NF-κB P65抗體(貨號：ab222494)來源于Abcam公司。

1.1.3儀器 CO2恒溫培養(yǎng)箱是Thermo 371系列；超凈臺為賽默飛Heraguard ECO型；離心機購自美國貝克曼庫爾特公司。倒置顯微鏡、分光光度計、熒光顯微鏡、凝膠成像系統(tǒng)及電泳儀購自美國伯樂公司。

1.1.4組織標本 標本取自南京醫(yī)科大學附屬南京醫(yī)院骨科截肢患者的手術(shù)膝骨關(guān)節(jié)軟骨，標本獲取均得到患者知情同意。

1.2方法

1.2.1細胞分組與藥物處理 人膝骨關(guān)節(jié)軟骨細胞分為4個組：對照組、川芎嗪組、LPS組和川芎嗪+LPS組。用用LPS(100 ng/ml)刺激軟骨細胞8 h誘導骨關(guān)節(jié)炎，用20 μmol/L的川芎嗪處理細胞24 h對照組用DMSO處理。

圖1 川芎嗪化學結(jié)構(gòu)式Fig.1 Chemical structure of ligustrazine

1.2.2軟骨細胞原代分離 首先將膝骨關(guān)節(jié)軟骨塊剪碎成1 mm3的小塊，放入離心管中，加入2倍體積的Ⅱ 膠原酶，置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中消化15 h。用60目濾網(wǎng)過濾上述混合液，濾液移入新的離心管中進行離心，800 r/min,6 min。棄上清，取下層渾濁液加入2倍體積的含15%胎牛血清和1%青-鏈霉素的DMEM-F12培養(yǎng)基混勻分裝到細胞培養(yǎng)瓶中，于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每3～5 d更換培養(yǎng)液。

1.2.3Hoechst33258染色檢測細胞凋亡 待測細胞接種于鋪有細胞爬片的培養(yǎng)皿中，37℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)至長滿60%～80%時，除去培養(yǎng)液，按照Hoechst33258染色試劑盒說明書對待測細胞依次進行固定，染色和封片。熒光顯微鏡下激發(fā)波長350 nm，發(fā)射波長460 nm觀察細胞，并統(tǒng)計凋亡細胞數(shù)目。

1.2.4蛋白印跡 各組細胞經(jīng)PBS清洗后加入含蛋白酶抑制劑的細胞裂解液提取總蛋白，100℃變性5 min。然后等量蛋白進行SDS-PAGE凝膠電泳分離并轉(zhuǎn)至PVDF膜。經(jīng)5%的BSA封閉1 h后加入相應(yīng)的一抗，4℃過夜孵育。第二天加入辣根過氧化物酶標記的二抗，室溫孵育1.5 h。最后加入發(fā)光液后于凝膠成像儀進行曝光拍照并統(tǒng)計灰度值計算相對表達量。

1.2.5酶聯(lián)免疫吸附實驗(Enzyme-linked Immunosorbentassay,ELISA) 收集待測細胞培養(yǎng)物上清，按照ELISA試劑盒說明書分別檢測NO、TNF-α和 IL-6的含量。首先樣品加入反應(yīng)孔后37℃孵育30 min，洗滌液洗滌后加入酶標試劑37℃反應(yīng)30 min。然后加顯色試劑37℃避光顯色15 min。最后加終止液終止反應(yīng)，450 nm處檢測各個反應(yīng)孔吸光值。

1.3統(tǒng)計學方法 用SPSS16.0軟件進行實驗數(shù)據(jù)的統(tǒng)計學分析，兩兩比較用獨立的t檢驗，P<0.05認為差異存在明顯統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1川芎嗪對LPS誘導的骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞形態(tài)及數(shù)目的影響 倒置顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，對照組和川芎嗪組細胞形態(tài)呈長梭狀，分布密集；LPS組多數(shù)細胞皺縮，形態(tài)異常，分布稀疏；LPS+川芎嗪組大部分細胞呈長梭狀，小部分有皺縮現(xiàn)象，分布較密集(圖2A)。圖2B顯示，LPS組細胞數(shù)目明顯少于對照組(P<0.05)。LPS+川芎嗪組細胞數(shù)目明顯多于LPS組(P<0.05)。由此可見，川芎嗪可改善LPS誘導的骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞形態(tài)異常及數(shù)目的下降。

2.2川芎嗪可減弱LPS誘導的骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞凋亡的增加 通過Hoechst33258染色檢測細胞凋亡，探究川芎嗪對LPS誘導的骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞凋亡的影響。圖3顯示，對照組和川芎嗪組細胞核完整、形態(tài)規(guī)則、呈橢圓形、為正常細胞。LPS組絕大多數(shù)細胞核呈致密濃染，形態(tài)異常，顏色有些發(fā)白，為凋亡細胞。LPS+川芎嗪組大部分為正常細胞。LPS組細胞凋亡率明顯高于對照組(P<0.05)。與LPS組相比，LPS+川芎嗪組細胞凋亡率明顯降低(P<0.05)。上述結(jié)果表明，川芎嗪可減弱LPS誘導的骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞凋亡的增加。

2.3川芎嗪對LPS誘導的骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞胞外基質(zhì)相關(guān)蛋白表達的影響 蛋白印跡檢測Ⅱ型膠原，聚集蛋白聚糖和MMP-13的表達，分析川芎嗪對LPS誘導的骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞胞外基質(zhì)相關(guān)蛋白表達的影響。如圖4所示，LPS組Ⅱ型膠原和聚集蛋白聚糖表達水平明顯低于對照組，MMP-13表達水平明顯高于對照組(P<0.05)。與LPS組相比，LPS+川芎嗪組Ⅱ型膠原和聚集蛋白聚糖表達水平明顯升高，MMP-13表達水平明顯下降(P<0.05)。由此可見，川芎嗪可抑制LPS誘導的骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞Ⅱ型膠原、聚集蛋白聚糖表達的減弱和MMP-13表達的增強。

圖2 川芎嗪對LPS誘導的骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞的影響Fig.2 Effect of ligustrazine on LPS-induced osteoar-thritis chondrocytesNote: A.The morphology chondrocytes;B.The umber of chondrocytes.*.P<0.05 vs control group,#.P<0.05 vs LPS group.

2.4川芎嗪會降低LPS誘導的骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞炎癥反應(yīng) 利用ELISA檢測炎癥因子NO、TNF-α和IL-6的含量，分析川芎嗪對LPS誘導的骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞炎癥反應(yīng)的影響。由圖5可知，LPS組NO、TNF-α和IL-6水平明顯高于對照組(P<0.05)。LPS+川芎嗪組NO、TNF-α和IL-6水平卻明顯低于LPS組(P<0.05)。以上結(jié)果說明，川芎嗪會降低LPS誘導的骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞炎癥反應(yīng)的增強。

2.5川芎嗪可抑制LPS誘導的骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞NF-κB P65磷酸化 為探究川芎嗪影響LPS誘導的骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞的分子機制，蛋白印跡檢測NF-κB P65的磷酸化水平。圖6顯示，各組細胞NF-κB P65蛋白水平無明顯差異，LPS組p-NF-κB P65蛋白水平最高。與對照組相比，LPS組p-P65/P65比值明顯升高(P<0.05)。LPS+川芎嗪組p-P65/P65比值明顯低于LPS組(P<0.05)。上述結(jié)果表明，川芎嗪可抑制LPS誘導的骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞NF-κB P65磷酸化水平的升高。

圖3 Hoechst33258染色檢測細胞凋亡Fig.3 Apoptosis was detected by Hoechst33258 stainingNote: *.P<0.05 vs control group;#.P<0.05 vs LPS group.

圖4 蛋白印跡檢測胞胞外基質(zhì)相關(guān)蛋白表達Fig.4 Expression of extracellular matrix-related proteins was tested by Western blotNote: *.P<0.05 vs control group;#.P<0.05 vs LPS group.

圖5 ELISA檢測炎癥因子水平Fig.5 Levels of inflammatory factor were measured by ELISANote: *.P<0.05 vs control group；#.P<0.05 vs LPS group.

圖6 蛋白印跡檢測NF-κBP65的磷酸化水平Fig.6 Phosphorylation of NF-κBP65 was detected by Western blotNote: *.P<0.05 vs control group；#.P<0.05 vs LPS group.

3 討論

膝骨關(guān)節(jié)炎是老年人的常見疾病，2010年中國50歲以上的人口占總?cè)丝诘?5.3%，中國膝骨關(guān)節(jié)炎的患病率相當高[11]。目前針對骨關(guān)節(jié)炎的治療策略主要包括生活方式的改變，外科手術(shù)、藥物治療及各種療法聯(lián)合治療等，以減輕癥狀，改善功能狀態(tài)，但這些方法具有一定的限制性[12]。近年來天然產(chǎn)物在疾病治療方面受到了越來越多的關(guān)注[13]。

細胞凋亡在各種疾病中發(fā)揮著重要作用，許多植物提取物都具有調(diào)節(jié)細胞凋亡的功效。Lu等[14]發(fā)現(xiàn)杜仲水提取物可抑制膝骨關(guān)節(jié)炎大鼠軟骨細胞凋亡。有研究表明石榴提取物可降低創(chuàng)傷性關(guān)節(jié)炎兔軟骨細胞凋亡[15]。據(jù)報道姜黃素具有抑制骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞凋亡的功能[16]。有研究發(fā)現(xiàn)川芎嗪具有抑制腦缺血誘導的細胞凋亡及輻射導致的淋巴細胞凋亡[6,17]。此外，川芎嗪還可抑制LPS誘導的大鼠腹膜間皮細胞凋亡和低氧誘導心肌細胞凋亡[18,19]。本研究結(jié)果顯示，川芎嗪可減弱LPS誘導的骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞凋亡的增加。

軟骨退化是骨關(guān)節(jié)炎的主要特征之一，骨關(guān)節(jié)炎患者常常出現(xiàn)細胞外基質(zhì)相關(guān)蛋白表達的異常，如基質(zhì)金屬蛋白酶表達的增強，Ⅱ型膠原、聚集蛋白聚糖蛋白水平下降[20]。越來越多的研究表明植物提取物可改善各類疾病中細胞外基質(zhì)的異常。Wang等[21]發(fā)現(xiàn)銀杏葉提取物EGb761可抑制TNF-α誘導的膝關(guān)節(jié)軟骨細胞MMP-13表達的增強和Ⅱ型膠原表達的降低。據(jù)報道羊棲菜提取物可減弱H2O2誘導的大鼠軟骨細胞Ⅱ型膠原、聚集蛋白聚糖蛋白表達的下降，抑制MMP-3和MMP-7表達的上升[22]。另外，在TNF-α誘導骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞中菜薊苦素可減弱MMP-13表達的增強和聚集蛋白聚糖蛋白水平的降低[23]。有研究發(fā)現(xiàn)川芎嗪可抑制腰椎間盤退變大鼠Ⅱ型膠原表達的降低和MMP-13表達的增強[24]。本文結(jié)果顯示，川芎嗪可抑制LPS誘導的骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞Ⅱ型膠原、聚集蛋白聚糖表達的減弱和MMP-13表達的增強。

炎癥反應(yīng)在骨關(guān)節(jié)炎中起著重要作用[25,26]。大量文獻報道植物提取物具有很好的抗炎作用。有數(shù)據(jù)顯示銀杏葉提取物EGb761可減弱LPS誘導的人軟骨細胞NO、PGE2和 IL-6水平的上升[27]。有研究表明桑葉提取物可抑制IL-1β誘導的人軟骨細胞NO和PGE2水平的升高[28]。在IL-1β誘導的骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞中，黃芩根提取物可減弱NO、IL-6和PGE2的釋放[29]。Kim等[30]發(fā)現(xiàn)川芎嗪可抑制淀粉樣蛋白(Amyloid β,Aβ)和干擾素-γ(Interferon-γ,INF-γ)誘導的大鼠小神經(jīng)膠質(zhì)細胞TNF-α、IL-1β及MCP-1水平的升高。本研究結(jié)果表明，川芎嗪會降低LPS誘導的骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞NO、TNF-α和IL-6水平的上升，減輕炎癥反應(yīng)。

NF-κB通路在各種疾病中起著重要調(diào)控作用[31]。許多植物提取物都可以逆轉(zhuǎn)各類疾病中NF-κB通路的異常。Haseeb等[32]發(fā)現(xiàn)富含多酚的石榴提取物會抑制IL-1β誘導的骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞NF-κB P65磷酸化水平的上升[32]。據(jù)報道川芎嗪可通過抑制NF-κB通路激活減輕創(chuàng)傷性腦損傷的神經(jīng)炎癥[33]。在骨肉瘤細胞中川芎嗪處理會導致NF-κB P65由細胞質(zhì)向細胞核的轉(zhuǎn)移受阻[34]。本文結(jié)果顯示，川芎嗪可抑制LPS誘導的骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞NF-κB P65磷酸化水平的升高。

本研究表明，在LPS誘導的骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞中，川芎嗪可改善軟骨細胞形態(tài)異常及數(shù)目的下降，減弱細胞凋亡的增加，抑制Ⅱ型膠原、聚集蛋白聚糖表達的減弱和MMP-13表達的增強，降低NO、TNF-α和IL-6水平的上升，減弱NF-κB P65磷酸化水平的升高。綜上所述，川芎嗪通過抑制NF-κB P65磷酸化減輕LPS誘導的骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞凋亡和炎癥反應(yīng)。下一步計劃在體內(nèi)研究川芎嗪對骨關(guān)節(jié)炎的影響。