劉 青

(西京學(xué)院醫(yī)學(xué)院,西安 710000)

糖尿病視網(wǎng)膜病變(Diabetic reinopathy,DR)是糖尿病最常見(jiàn)的微血管并發(fā)癥[1,2]。目前，DR發(fā)病的增長(zhǎng)速度雖然已得到了一定的控制，但其仍是導(dǎo)致成年人失明的主要原因之一[3]。研究表明，視網(wǎng)膜炎癥、細(xì)胞凋亡、脂質(zhì)過(guò)氧化及異常血管增生都是導(dǎo)致DR惡化的主要原因[4-7]。因此，若能有效調(diào)控DR的多個(gè)病理環(huán)節(jié)將有利于DR的治療。五味子乙素(Schisandrin B,SB)是中藥五味子的主要有效成分之一，其具有抗炎、抗癌、抗氧化等藥理學(xué)功效[8-10]。研究表明，五味子可抑制糖尿病大鼠鈉葡萄糖共轉(zhuǎn)運(yùn)載體的活性[11]。五味子素可對(duì)抗煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NAPDH)誘導(dǎo)的糖尿病腎病氧化損傷，提高糖尿病大鼠對(duì)胰島素的敏感性[12,13]。也有研究表明，SB可減輕四氯化碳(Carbon tetrachloride,CCl4)誘導(dǎo)的糖尿病大鼠肝損傷[14]。但其對(duì)DR的作用還未見(jiàn)報(bào)道。因此，本文將采用鏈脲佐菌素(Streptozotocin,STZ)復(fù)制大鼠DR模型，探討SB對(duì)DR的作用及作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1試劑與儀器 超氧化物歧化酶(Superoxide dismtase,SOD)、丙二醛(Malondiadehyde,MDA)和乳酸鹽脫氫酶(Lactate dehydrogenase,LDH)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所。白介素-6(Lnterleukin-6,IL-6)、IL-1β和腫瘤壞死因子(Tumor necrosis factor,TNF-α)ELISA試劑盒購(gòu)自美國(guó)Miliipore公司。SB購(gòu)自北京索萊寶公司。內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司，細(xì)胞分裂周期蛋白42(Cell division cycle,Cdc42)和p-p38一抗購(gòu)自美國(guó)CST公司。

1.2方法

1.2.1動(dòng)物模型的建立 Wistar大鼠購(gòu)自上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心。將大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后，隨機(jī)分為對(duì)照組、SB 組、STZ組和STZ+SB 組。實(shí)驗(yàn)前12 h禁食禁水。STZ組和STZ+SB 組大鼠一次性腹腔注射STZ(58 mg/kg)誘導(dǎo)高血糖，對(duì)照組和SB組注射等量生理鹽水，3 d后尾靜脈取空腹血，用血糖儀檢測(cè)血糖濃度，血糖濃度高于400 mg/dl(22 mmol/L)視為造模成功。剔除造模未成功的大鼠，SB組和STZ+SB 組大鼠連續(xù)灌胃給予SB(50 mg/kg)9個(gè)月。9個(gè)月后摘取眼球并收集血液進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2TUNEL 摘取大鼠眼球，用4%多聚甲醛固定過(guò)夜后，去除晶狀體，使余下組織包含全部視網(wǎng)膜，制作視網(wǎng)膜石蠟切片。根據(jù)TUNEL試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)凋亡小體。切片脫蠟后，用3%的H2O2處理10 min。滴加0.5%的Proteinase K 37℃孵育10 min，隨后加入TdT和生物素標(biāo)記的dUTP混合液37℃處理30 min，棄去混合液，待玻片干后，滴加TUNEL混合液，最后滴加DAB顯色，蘇木精復(fù)染、脫水、封片。于顯微鏡下每片隨機(jī)選取6個(gè)視野進(jìn)行計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)。

1.2.3SOD、MDA和LDH含量的檢測(cè) 將實(shí)驗(yàn)所得全血以3 000 r/min的轉(zhuǎn)速4℃離心15 min，取上清液，根據(jù)試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)上清液中SOD、MDA和LDH的含量。

1.2.4ELISA 根據(jù)ELISA試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)全血上清液中IL-6、TNF-α和IL-1β的含量。

1.2.5Western blot 用蛋白裂解液和蛋白酶抑制劑混合液提取視網(wǎng)膜組織蛋白。用BCA試劑盒檢測(cè)總蛋白質(zhì)濃度并調(diào)平。10% SDS-PAGE分離各組蛋白質(zhì)并轉(zhuǎn)移至PVDF膜。用5%脫脂牛奶室溫封閉PVDF膜2 h，隨后加入一抗(VEGF,1∶1 000;Cdc42,1∶1 000;p-p38,1∶1 000)，4℃封閉過(guò)夜。第2天用TBST洗膜3次后，加入HRP標(biāo)記的二抗于室溫孵育1 h，最后加入ECL顯色液曝光顯影。

2 結(jié)果

2.1SB 對(duì)DR大鼠血糖的影響 為了檢測(cè)DR大鼠模型是否建立成功，我們檢測(cè)了STZ注射3 d后大鼠的血糖濃度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與對(duì)照組比較，SB組大鼠血糖無(wú)明顯變化(P>0.05，圖1)，STZ組血糖濃度明顯升高(P<0.001，圖1)，且高于22 mmol/L，表明造模成功；同時(shí)，SB 能明顯減弱STZ誘導(dǎo)血糖升高的作用(P<0.05，圖1)。

2.2SB對(duì)視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡的影響 為了探究SB 對(duì)DR大鼠視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡的影響，我們檢測(cè)了凋亡小體的形成情況。STZ可顯著促進(jìn)視網(wǎng)膜凋亡小體的形成(P<0.001，圖2)，SB 則能明顯減弱STZ對(duì)凋亡小體形成的誘導(dǎo)作用(P<0.05，圖2)。

2.3SB 對(duì)DR大鼠氧化應(yīng)激的影響 為了探究SB對(duì)STZ誘導(dǎo)的DR大鼠氧化應(yīng)激的影響，我們檢測(cè)了外周血中SOD、MDA和LDH的含量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，STZ可明顯降低血清中SOD的含量，促進(jìn)MDA和LDH的分泌(P<0.01，圖3)。SD能顯著減弱STZ對(duì)SOD分泌的抑制作用，降低MDA和LDH的含量(P<0.05，圖3)。

2.4SB 對(duì)DR大鼠炎癥反應(yīng)的影響 ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與對(duì)照組比較，SB組炎癥因子IL-6、TNF-α和IL-1β的含量無(wú)顯著變化(P>0.05，圖4)，STZ組IL-6、TNF-α和IL-1β的含量明顯增多(P<0.01，P<0.001,圖4)；與STZ 組比較，STZ+SB組血清中IL-6、TNF-α和IL-1β含量明顯增多(P<0.05，圖4)。

2.5SB 對(duì)Cdc42/P38通路的影響 為了探究SB對(duì)STZ誘導(dǎo)的DR的作用機(jī)制，我們檢測(cè)了血管新生標(biāo)記分子VEGF及其下游信號(hào)通路蛋白的表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，STZ能顯著促進(jìn)VEGF、Cdc42和p-p38的表達(dá)(P<0.01，P<0.001,圖5)，SB能顯著下調(diào)DR大鼠視網(wǎng)膜VEGF、Cdc42和p-p38的蛋白表達(dá)水平(P<0.05，圖5)。

圖1 SB對(duì)DR大鼠血糖的影響Fig.1 Effect of SB on blood glucose level of ratsNote: A.The chemical structural formula of SB;B.The quantification of blood glucose of rats.***.P<0.001 vs control group；#.P<0.05 vs STZ group.

圖2 SB對(duì)視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡的影響

圖3 SB對(duì)DR大鼠氧化應(yīng)激的影響Fig.3 Effect of SB on oxidative stress of DR ratsNote: The concentrations of SOD,MDA and LDH were measured by kits.**.P<0.01 vs control group;#.P<0.05 vs STZ group.

圖4 SB對(duì)DR大鼠炎癥反應(yīng)的影響Fig.4 Effect of SB on inflammation of DR ratsNote: The concentrations of IL-6,TNF-α and IL-1β were determined by ELISA assay.**.P<0.01,***.P<0.001 vs control group;#.P<0.05 vs STZ group.

圖5 SB 對(duì)Cdc42/p38通路的影響Fig.5 Effect of SB on Cdc42/p38 signaling pathwayNote: A.The protein levels of VEGF,Cdc2 and p-p38 were measured by Western blot;B.The quantification of protein levels of VEGF,Cdc2 and p-p38.GAPDH was used as loading control.**.P<0.01,***.P<0.001 vs control group;#.P<0.05，##.P<0.001 vs STZ group.

3 討論

細(xì)胞凋亡是導(dǎo)致DR的重要機(jī)制之一[15]。在DR中，新陳代謝紊亂會(huì)導(dǎo)致視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡、糖基化終產(chǎn)物的形成、白細(xì)胞聚集及氧化應(yīng)激的發(fā)生[6]。研究表明，視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞的凋亡會(huì)導(dǎo)致視網(wǎng)膜功能減退，周細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡是引起血管滲透性增高的主要原因[4,16,17]。在本研究中，我們采用腹腔注射STZ的方法復(fù)制大鼠DR模型并給予大鼠SB 9個(gè)月。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，SB對(duì)正常大鼠的凋亡小體形成沒(méi)有明顯影響，表明該劑量下的SB對(duì)視網(wǎng)膜細(xì)胞沒(méi)有明顯的毒副作用。但SB能顯著抑制DR大鼠視網(wǎng)膜凋亡小體形成，表明SB具有抗DR大鼠視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡的作用。

研究表明，DR的高糖和高脂肪酸環(huán)境能通過(guò)激活線粒體電子傳遞鏈誘導(dǎo)過(guò)氧化物的生成，從而導(dǎo)致脂質(zhì)過(guò)氧化，脂質(zhì)過(guò)氧化能進(jìn)一步降低細(xì)胞膜的流動(dòng)性、影響Na+-K+平衡、使細(xì)胞膜通透性升高，同時(shí)還能改變線粒體膜電位，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[18,19]。大量研究表明，中藥有效成分具有抗DR氧化應(yīng)激的作用。如柚苷、橙皮素和生草酚等均可通過(guò)調(diào)控SOD、MDA及NO等的表達(dá)減緩DR的發(fā)展[20-22]。也有研究表明，SB可通過(guò)調(diào)控ROS通路減輕NAPDH氧化酶對(duì)糖尿病腎病系膜細(xì)胞的損傷[12]。本文研究發(fā)現(xiàn)，SB可明顯促進(jìn)SOD的分泌，降低DR大鼠血清MDA和LDH的含量。其中，SOD是超氧陰離子自由基清除劑，可減少過(guò)氧化氫的生成[23]。MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)鏈的終產(chǎn)物，因此，其含量的變化反映了脂質(zhì)過(guò)氧化程度[24]。LDH是參與糖酵解和糖異生的重要酶。在正常情況下，血清中LDH的含量較少，但當(dāng)細(xì)胞膜通透性增加時(shí)，LDH可大量的進(jìn)入血液[25]。結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，SB可減輕STZ誘導(dǎo)的DR大鼠視網(wǎng)膜的脂質(zhì)過(guò)氧化，增強(qiáng)DR大鼠抗自由基損傷的能力，從而降低細(xì)胞膜通透性。

研究表明，TNF-α、IL-1β、IL-6等炎癥因子表達(dá)增多可誘導(dǎo)DR模型鼠視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)和功能的改變[26,27]。下調(diào)IL-1β的表達(dá)可抑制視網(wǎng)膜毛細(xì)血管的退化[26]。玻璃體內(nèi)注射TNF-α可抑制糖尿病大鼠視網(wǎng)膜周細(xì)胞凋亡和毛細(xì)血管變性[27]。敲除TNF-α基因可降低糖尿病小鼠視網(wǎng)膜血管通透性、減少白細(xì)胞黏附[28]。本文研究發(fā)現(xiàn)，TNF-α、IL-1β和IL-6在STZ誘導(dǎo)的DR大鼠外周血中均呈高表達(dá)狀態(tài)，SB能顯著降低血清中TNF-α、IL-1β和IL-6的含量，表明SB可抑制STZ誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。

VEGF是調(diào)控血管新生的重要細(xì)胞因子，能夠促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移及基底膜的降解，在促進(jìn)視網(wǎng)膜血管新生過(guò)程中發(fā)揮重要作用[29]。視網(wǎng)膜血管新生是指視網(wǎng)膜血管的異常生長(zhǎng)，也是增殖性DR的重要特征[30]。同時(shí)，VEGF還可調(diào)控DR炎癥反應(yīng)，可促進(jìn)黏附因子及炎癥的表達(dá)，誘導(dǎo)白細(xì)胞激活[31]。因此，下調(diào)VEGF表達(dá)被認(rèn)為是目前治療DR最可行的方法。并且哌加他尼、蘭尼單抗及阿伐斯汀等VEGF抑制劑已進(jìn)入治療DR的臨床試驗(yàn)階段[30]。我們的研究發(fā)現(xiàn)，SB可明顯抑制VEGF的表達(dá)。此外，SB還能明顯抑制DR大鼠Cdc42和p-p38的表達(dá)。Cdc42和p38是VEGF下游Cdc42/p38信號(hào)通路的標(biāo)記蛋白。研究表明，VEGFR2是主要參與調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移的VEGF受體[32]。VEGF與VEGFR2結(jié)合后，VEGFR2首先進(jìn)行自身磷酸化進(jìn)而激活Cdc42，活化的Cdc42和VEGFR2又可進(jìn)一步激活p38，誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞遷移[33]。也有研究表明，IL-4可通過(guò)調(diào)控Cdc42-p38 MAPK通路促進(jìn)IL-6的表達(dá)，提示Cdc42/p38信號(hào)通路可能也參與了炎癥反應(yīng)的調(diào)控[34]。結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，SB可下調(diào)VEGF表達(dá)并可通過(guò)Cdc42/p38信號(hào)通路抑制STZ誘導(dǎo)的DR大鼠視網(wǎng)膜炎癥反應(yīng)和血管新生。

綜上所述，SB可降低DR大鼠血糖水平、抑制視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡及氧化應(yīng)激，可通過(guò)抑制炎癥因子及VEGF的表達(dá)抑制視網(wǎng)膜炎癥反應(yīng)及血管新生，并且其機(jī)制與抑制Cdc42/p38信號(hào)通路激活有關(guān)。