額日赫木，鄧慧清，張 琪，楊亞萍，崔 娜

（山西師范大學食品科學學院，農(nóng)產(chǎn)品加工與貯藏實驗室，山西臨汾 041004）

馬鈴薯是世界上四大糧食作物之一。2010年，全世界馬鈴薯的總產(chǎn)量達到了3.2×108t左右，而且生產(chǎn)量和消費量都呈上升趨勢[1]。中國是世界上最大的馬鈴薯生產(chǎn)國，占世界生產(chǎn)量的近1/4[2]。馬鈴薯塊莖中淀粉含量占濕基總質量的15%左右，作為高級淀粉已被廣泛用于醫(yī)藥、化工、食品等諸多領域[3]。而馬鈴薯渣是加工淀粉后的主要副產(chǎn)物，是由細胞碎片、細胞壁殘余物、殘余淀粉顆粒及細胞壁、薯皮細胞或細胞結合物等構成[4]。半纖維素作為薯渣中的主要成分之一，其含量占薯渣干基總質量的14%左右[5]，因此具有較高的再利用價值。目前，國內(nèi)外對于馬鈴薯渣的利用已進行了諸多研究報道，主要集中在如生產(chǎn)燃料級酒精、生產(chǎn)動物飼料、提取果膠和膳食纖維等方面[6-10]，但關于馬鈴薯渣半纖維素的開發(fā)利用方面的報道甚少。

超聲波作為非熱物理技術，已被廣泛應用于食品領域中。它是物質介質中的一種彈性機械波，利用其振動能量，可以在介質中產(chǎn)生強大的剪切力和高溫，來改變物質的組織結構、狀態(tài)及功能[11]；空化效應、熱效應和機械作用是超聲技術應用的理論依據(jù)，而空化效應被認為是最重要的理論依據(jù)，其可以導致充氣氣泡的產(chǎn)生及微射流的出現(xiàn)[12]。近年來，超聲波技術在食品工業(yè)中得到了較好的應用，如在食品酶類研究中尤為廣泛[13]。一些研究證實通過改變超聲處理條件可以改變酶活性。例如，超聲波處理可以提高液體α-淀粉酶的酶學活性[14]、提高胰蛋白酶的酶解效率[15]、降低果膠甲基酯酶活性等[16]，這些研究為超聲波在酶學活性研究提供了很好的理論基礎。

試驗利用超聲波預處理半纖維素酶，試圖提高其酶活性，從而使馬鈴薯渣半纖維素的酶解效率得到提高。首先，考查半纖維素酶的最佳酶解條件，即pH值、水浴溫度及水浴時間對酶活性的影響；其次，考查超聲處理條件（超聲功率、超聲處理時間）對半纖維素酶活性產(chǎn)生的影響；最后，考查超聲處理后的半纖維素酶在不同放置時間內(nèi)的活性變化。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

晉薯16號馬鈴薯，產(chǎn)自山西呂梁；3,5-二硝基水楊酸（化學純），上海弘順生物科技有限公司提供；葡萄糖（分析純），南京化學試劑股份有限公司提供；半纖維素酶（食品級，活性2 000 U/g)，上海寶豐生化有限公司提供。

PHS-25型數(shù)顯pH計，上海儀電科學儀器股份有限公司產(chǎn)品；752型紫外可見分光光度計，上海菁華科技儀器有限公司產(chǎn)品；TD5G型離心機，湖南凱達科學儀器有限公司產(chǎn)品；FS-1200N型超聲波處理器（20 kHz頻率，1 200 W，最大功率Ф20 mm變幅桿），上海生析超聲波有限公司產(chǎn)品；DZF-6050型真空干燥箱，上海一恒科學儀器有限公司產(chǎn)品。

1.2 試驗方法

1.2.1 溶液的配制

（1）DNS試劑的配制。參照朱海霞等人[17]的研究并加以改動。準確稱取6.5 g的3,5-二硝基水楊酸，用蒸餾水充分溶解待用。準確稱取40 g的氫氧化鈉用蒸餾水充分溶解，冷卻后移入500 mL容量瓶定容，得到濃度為2 mol/L的溶液備用。將上述水楊酸溶液移入1 000 mL的容量瓶中，并加入325 mL的氫氧化鈉溶液，再加入15 mL丙三醇溶液待溶解后定容到 1 000 mL刻度，并移入棕色試劑瓶中貯藏（4℃） 待用。

（2） 乙酸-乙酸鈉緩沖溶液的配制。準確量取11.55 mL的冰乙酸，定容量1 000 mL，即得到濃度為0.2 mol/L的乙酸溶液；準確稱取16.4 g的無水乙酸鈉，溶于蒸餾水后定容量1 000 mL，即得到濃度為0.2 mol/L的乙酸鈉溶液。由此分別配制不同pH值的乙酸-乙酸鈉緩沖溶液。

（3）馬鈴薯渣和半纖維素酶溶液的制備。馬鈴薯洗凈后切塊，打漿過濾，濾渣經(jīng)流水沖洗數(shù)次去除淀粉、蛋白質等雜質，再經(jīng)蒸餾水洗凈3次得到殘渣（濕質量），將殘渣置于鼓風干燥箱在75℃條件下干燥12 h。再將干物質粉碎，過篩（100目），后同等溫度下再次干燥2 h后置于密封干燥器中。準確稱取1.01 g的上述干燥樣品，移入100 mL的燒杯中，加入75 mL乙酸-乙酸鈉緩沖溶液進行攪拌溶解，再將其移入到100 mL容量瓶中定容至刻度，得到1%的樣品溶液備用。根據(jù)所用pH值的不同，再分別利用乙酸-乙酸鈉緩沖溶液配制質量分數(shù)為0.1%的半纖維素酶溶液（現(xiàn)配現(xiàn)用）。

1.2.2 試驗設計

（1）半纖維素酶作用條件篩選?？疾閜H值、水浴溫度、水浴時間等條件對半纖維素酶活性的影響。以馬鈴薯渣的酶解產(chǎn)物中還原糖濃度值來表示半纖維素酶活性值（由于未確定酶解反應時間，計算酶活性無意義）。

半纖維素酶解反應條件的設計見表1。

（2） 超聲波處理條件的篩選?？疾槌暪β屎统晻r間對半纖維素酶活性的影響。將300 mL的質量分數(shù)為1%半纖維素酶溶液移入500 mL的燒杯中，再將其置于超聲波處理裝置內(nèi)，在不同超聲條件下進行處理，變幅桿探頭進入酶溶液深度為1 cm。由于超聲處理過程中溶液溫度會升高而可能導致酶活性發(fā)生變化，因此在全過程中進行冷卻處理。

表1 半纖維素酶解反應條件的設計

超聲波處理系統(tǒng)見圖1，超聲波預處理條件的設定見表2。

（3） 半纖維素酶活性在不同放置時間內(nèi)的變化。在相同的超聲波處理條件下，對半纖維素酶進行超聲波處理，在室溫下（25℃） 放置0，0.5，1.5，2.0，2.5 h，考查其酶活性的變化。

1.2.3 葡萄糖標準曲線的制作

圖1 超聲波處理系統(tǒng)

表2 超聲波預處理條件的設定

參照趙凱等人[18]的研究并加以改動。準確稱取0.5 g葡萄糖溶解于蒸餾水中定容到500 mL容量瓶中，即質量濃度為1 mg/mL。按表3進行操作，將溶液混勻后置于沸水浴中加熱并保持5 min。經(jīng)冰水冷卻后分別向各試管中加入4 mL蒸餾水，充分搖勻。以試管編號1作為空白對照，于波長540 nm處測定各樣品的吸光度，并繪制出吸光度-葡萄糖質量濃度曲線。

葡萄糖標準曲線的制作見表3。

表3 葡萄糖標準曲線的制作/mL

以葡萄糖質量濃度為X軸、吸光度為Y軸，進行線性回歸，并求得線性回歸方程：Y=0.887 4X-0.003 2，R2=0.997 2。

葡萄糖標準曲線見圖2。

圖2 葡萄糖標準曲線

1.2.4 半纖維素酶活性的測定

參照謝現(xiàn)英[19]研究并加以改動。將質量分數(shù)為1%的薯渣溶液1 mL移入10 mL的刻度試管中，加入質量分數(shù)為0.0.1%的半纖維素酶溶液0.5 mL，置于水浴鍋中加熱反應；再加入1 mL的DNS試劑，置于沸水浴中反應15 min。待冷卻至室溫后將反應溶液定容至10 mL，于波長540 nm處測定其吸光度。

對照組加入質量分數(shù)為1%的馬鈴薯渣溶液1 mL，再加入蒸餾水0.5 mL，其他條件則不變。

半纖維素酶活性定義：在一定條件下，1 min內(nèi)1 g半纖維素酶分解馬鈴薯渣所產(chǎn)生的還原糖（以葡萄糖計） 量（mg）。

根據(jù)以上標準曲線得出葡萄糖質量濃度，則

式中：C——葡萄糖質量濃度，mg/mL；

V——定容后的體積，mL；

0.000 5——每次反應所用的酶量，g；

t——反應時間，min；

4——稀釋倍數(shù)。

2 結果與分析

2.1 馬鈴薯渣酶解條件的篩選

不同pH值對還原糖質量濃度的影響見圖3。

圖3 不同p H值對還原糖質量濃度的影響（n=5）

由圖3可知，半纖維素酶分解馬鈴薯渣半纖維素所得的還原糖制質量濃度在pH值為5.5時顯示最大值，即0.339 mg/mL，然而其與pH值5.0和pH值6.0時相比，并無顯著性差異（p＞0.05）。因此，可以確定半纖維素酶在pH值5.0～6.0時具有較好的酶解能力，得到的還原糖質量濃度值越大，表明半纖維素酶活性就越高。姜立春等人[20]研究表明，pH值為6.5時半纖維素酶活性最大，即此時分解底物所得的還原糖質量濃度最高。而薛海曌[21]在研究中表明，在pH值為5.0時，半纖維素酶活性達到最大值。由于pH值的變化會影響酶分子的空間構象，而可能導致酶活性發(fā)生改變，繼而使酶解反應速率發(fā)生改變。因此，可以判斷半纖維素酶的最佳酶解pH值應在5.0～6.0。

不同水浴溫度對還原糖質量濃度的影響見圖4。

圖4 不同水浴溫度對還原糖質量濃度的影響

由圖4可知，半纖維素酶分解馬鈴薯渣半纖維素產(chǎn)出的還原糖質量濃度，隨著水浴溫度的提高，出現(xiàn)先升高后降低的趨勢。水浴溫度在50℃時，產(chǎn)物還原糖質量濃度顯示最大值，即0.362 mg/mL，這表明此時半纖維素酶活性最高。而水浴溫度為60℃時，產(chǎn)物還原糖質量濃度雖然出現(xiàn)下降，即0.349 mg/mL，但與 50℃相比較并無顯著性差異（p＞0.05）。相關研究如楊立霞等人[22]表明，2種半纖維素酶，即β-木聚糖酶和β-甘露聚糖酶都在50℃時顯示最高活性值。而魏曉飛等人[23]研究發(fā)現(xiàn)，β-葡聚糖酶的酶學性質隨著酶解溫度的變化而發(fā)生改變，當酶解溫度為37℃時，β-葡聚糖酶呈現(xiàn)最高活性。由此可見，半纖維素酶最佳反應溫度取決于酶的種類和含量，當半纖維素酶處于多種類混合狀態(tài)時，其最佳酶解溫度可能發(fā)生不同程度的改變（如圖4所示）。因此，根據(jù)產(chǎn)物還原糖質量濃度，可以確定半纖維素酶的最佳酶解溫度為50～60℃。

不同水浴時間對還原糖質量濃度的影響見圖5。

圖5 不同水浴時間對還原糖質量濃度的影響

由圖5可知，隨著水浴時間的延長，半纖維素酶分解馬鈴薯渣半纖維素所得還原糖質量濃度會增大，但超過25 min時略有降低。水浴時間為25 min時，產(chǎn)物還原糖質量濃度顯示最高值（0.381 mg/mL），然而在15～45 min時，產(chǎn)物還原糖質量濃度并無顯著性差異（p＞0.05）。從節(jié)能的角度考慮，水浴時間在15 min時，半纖維素酶能夠有效地酶解馬鈴薯渣半纖維素。

綜上所述，根據(jù)馬鈴薯渣半纖維素分解所得產(chǎn)物還原糖質量濃度，可選擇pH值為5.0～6.0，水浴溫度為50℃，水浴時間為15 min時，為半纖維素酶的最佳酶解條件。這表明在此條件下半纖維素酶具有最高的酶學活性和酶解效率。

2.2 超聲波預處理條件的篩選

超聲功率對半纖維素酶活性的影響見圖6。

圖6 超聲功率對半纖維素酶活性的影響

由圖6可知，超聲功率增加至360 W時，半纖維素酶活性開始增大，當超聲功率增加至600 W時，酶活性顯示最高值（203 mg/g·min），與未經(jīng)超聲處理的酶溶液相比，其活性提高了23.35%。而超聲功率超過600 W時，半纖維素酶活性并未呈現(xiàn)升高趨勢，反而會出現(xiàn)下降趨勢。超聲處理條件不同，對酶類活性產(chǎn)生的影響也是不同的[24]，如木瓜蛋白酶在超聲功率為40 W時，與未超聲處理酶溶液相比，其活性提高了9%[25]；而一些研究表明，POD酶、ATP酶等其活性會隨著超聲功率的增加而降低[26]。酶活性的高低主要取決于酶分子空間構象的合理程度，高強度超聲處理酶溶液時會產(chǎn)生瞬態(tài)空化作用，熱效應及機械作用，而酶分子在強大的剪切力和沖擊波的作用下，分子空間結構可能被改變，如二級結構的組成變化（α-螺旋、β-折疊、γ-轉角等）、三級結構次級鍵的變化、分子形態(tài)變化等都可能是酶活性被改變的原因[27]。

超聲處理時間對半纖維素酶活性的影響見圖7。

圖7 超聲處理時間對半纖維素酶活性的影響

由圖7可知，半纖維素酶活性隨著超聲時間的延長，呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，超聲時間為8 min時顯示最高活性（205.46 mg/g·min），這與未處理酶溶液相比，其活性提高了33%。然而在4～8 min其酶活性并無顯著性差異（p＞0.05），因此可選擇4 min為最佳超聲時間。由于連續(xù)的超聲波場致效應改變了酶分子的空間構象，可能使其活性中心更多的暴露并與底物結合，從而導致了酶活力在0～8 min內(nèi)逐漸上升。當時間延長至10 min時，酶活性開始呈現(xiàn)下降趨勢，這可能由于長時間的超聲波場致效應，導致其分子空間結構進一步被改變，甚至活性中心結構被破壞。張永軍等人[28]研究表明，在超聲時間為5 min時，木瓜蛋白酶活性與未處理相比，其活性提高了19%。石文奇等人[14]研究表明，當超聲功率為80 W，超聲時間為4 min時，α-淀粉酶活性顯示最大值。因此，這些研究證明在適當?shù)某曁幚項l件（如功率、時間等）下可以改變酶學活性，并同時取決于酶的種類。

2.3 半纖維素酶活性在不同放置時間內(nèi)的變化

不同放置時間對半纖維素酶活性的影響見圖8。

圖8 不同放置時間對半纖維素酶活性的影響

由圖8可知，隨著放置時間的延長半纖維素酶活性呈現(xiàn)下降趨勢。經(jīng)超聲波處理的半纖維素酶在放置時間為0～0.5 h內(nèi)，其酶活性并無顯著變化（p＞0.05），依然保持著較高的酶活性 （194～195 mg/g·min）。然而，隨著放置時間的延長（1.0～2.5 h） 半纖維素酶活性呈現(xiàn)降低趨勢，而與未處理酶溶液相比，仍然多保持了19%以上的酶活性（p＜0.05）。由此可見，超聲波處理后的半纖維素酶在2.5 h的放置時間內(nèi)仍然保持了較高的活性。

綜上所述，在超聲功率為600 W，超聲時間為4 min時，半纖維素酶顯示最高活性。超聲波處理后半纖維素酶在放置時間為0～2.5 h內(nèi)，與未經(jīng)超聲處理的半纖維素酶相比仍然保持了較高的活性。除超聲功率和超聲時間外，半纖維素酶濃度及底物（馬鈴薯渣）濃度也是影響酶解速率的2個主要原因。然而，為了避免酶濃度過高或底物濃度過低而掩蓋超聲處理的作用，因此本研究中分別使用了質量分數(shù)為0.1%的半纖維素酶及質量分數(shù)為1%的底物。而這一結果已通過預試驗得以證明。

3 結論

結果表明，半纖維素酶分解馬鈴薯渣半纖維素的最佳作用條件是pH值為5.0～6.0，水浴溫度為50℃，水浴時間為15 min。超聲功率為600 W，超聲時間為4 min時，可作為半纖維素酶的最佳處理條件。在此條件下，半纖維素酶可將馬鈴薯渣中的半纖維素更加快速酶解為還原糖。同時，在超聲波處理后的0～2.5 h內(nèi)，與未經(jīng)超聲波處理的半纖維素酶相比仍然保持著較高的活性。

通過超聲波預處理后半纖維素酶活性得到了有效的提高，從而使馬鈴薯渣的酶解效率得到了提高。試驗為食品副產(chǎn)物的綜合利用提供了理論依據(jù)，同時也拓展了超聲波技術在食品酶類研究中的應用。