賈松華 岳秉飛

(中國(guó)食品藥品檢定研究院，北京 100050)

貓(cat;feliscatus)屬于哺乳綱、食肉目、貓科、貓屬動(dòng)物。染色體數(shù)為2n=38。據(jù)考古發(fā)現(xiàn)[1]，人類對(duì)貓的馴化可追溯到大約9500年前；之后，Driscoll等[2]和Lipinski等[3]分別對(duì)貓的群體結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分子遺傳學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)人類對(duì)貓的馴化始于地中海東部沿岸地區(qū)。過(guò)去，由于農(nóng)業(yè)和交通運(yùn)輸?shù)男枰祟悓?duì)牛，羊，馬等進(jìn)行了馴化。但對(duì)人類而言，貓并沒(méi)有直接的經(jīng)濟(jì)意義或者社會(huì)意義，只是作為驅(qū)逐捕殺危害鼠類的工具。所以貓并沒(méi)有被完全的馴化，仍保留一定的野性[4-5]。直至一百多年前，人類才根據(jù)貓的毛色，毛發(fā)長(zhǎng)短，體型等特征進(jìn)行人工篩選，培育遺傳背景明確的品種貓[6-7]。目前，貓分為家貓和品種貓兩大類。家貓是家庭豢養(yǎng)貓的統(tǒng)稱，一般是隨機(jī)交配的貓。品種貓是指經(jīng)培育而成，每個(gè)品種貓都具有特定的遺傳特征[8]。美國(guó)兩個(gè)最大的貓網(wǎng)站系統(tǒng)CFA(the Cat Fanciers’ Association)，TICA(The International Cat Association)在2018年登記的品種貓種類分別為42種，38種。另外，可將品種貓簡(jiǎn)單地分為長(zhǎng)毛貓和短毛貓。其中短毛貓宜作為實(shí)驗(yàn)用貓，因?yàn)殚L(zhǎng)毛貓易污染實(shí)驗(yàn)環(huán)境、實(shí)驗(yàn)操作不便，且體質(zhì)較弱，實(shí)驗(yàn)?zāi)褪苄圆頪9]。

貓作為實(shí)驗(yàn)用動(dòng)物始于19世紀(jì)末。在神經(jīng)學(xué)，藥理學(xué)，心血管系統(tǒng)等研究方面，實(shí)驗(yàn)用貓具有其他實(shí)驗(yàn)動(dòng)物無(wú)法比擬的優(yōu)勢(shì)[10]。比如，貓有極其敏感的神經(jīng)系統(tǒng)，是研究腦神經(jīng)生理學(xué)的絕好實(shí)驗(yàn)動(dòng)物[8]；它的血壓最為穩(wěn)定，《中國(guó)藥典》明確指出貓?jiān)谒幤窓z驗(yàn)中用于降壓物質(zhì)的檢查[11]。與鼠科動(dòng)物模型相比，貓?bào)w型大，長(zhǎng)壽(一般為12～30年)，具有與人類更相似的生理學(xué)特征，這些優(yōu)點(diǎn)使貓更適合檢測(cè)某些治療方法的安全性和有效性[9, 12]。隨著人類對(duì)品種貓的定向篩選培育，越來(lái)越多與人類同源的貓遺傳性疾病被發(fā)現(xiàn)。目前確定的貓遺傳性疾病已超過(guò)了250種，其中包括在波斯貓(Persiancats)中發(fā)現(xiàn)的多囊性腎病(PKD)，以及在德文萊克斯貓(DevonRexcats)中觀察到的先天性肌肉萎縮癥。貓為研究人類很多罕見(jiàn)的遺傳疾病提供了寶貴的動(dòng)物模型[13-16]。同時(shí)，患有某些感染性疾病的貓是人類很好的自然動(dòng)物模型。在研究人類獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)中，轉(zhuǎn)基因鼠和貓免疫缺陷是目前運(yùn)用最多的非靈長(zhǎng)類動(dòng)物模型。感染有冠狀病毒(FeCoV)的貓可用于研究SARS的臨床癥狀[12, 17-20]。

綜上所述，貓用于科學(xué)實(shí)驗(yàn)具有一定的現(xiàn)實(shí)意義。但與此同時(shí)，我國(guó)也面臨著實(shí)驗(yàn)用貓緊缺的問(wèn)題[21]。目前我國(guó)實(shí)驗(yàn)用貓多數(shù)購(gòu)自市場(chǎng)，經(jīng)隔離檢疫、嚴(yán)格篩選后使用；目前為止，我國(guó)90%以上的教學(xué)科研實(shí)驗(yàn)用貓都是從商販或“收購(gòu)型飼養(yǎng)場(chǎng)”購(gòu)買。其來(lái)源混雜，遺傳背景模糊，所攜帶微生物不明等情況，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性、科學(xué)性以及重現(xiàn)性都有直接影響[5, 21-22]。為了提高實(shí)驗(yàn)用貓的質(zhì)量，使其更易用于科研和生產(chǎn)，近年來(lái)我國(guó)一些單位對(duì)供實(shí)驗(yàn)使用的貓進(jìn)行了專門的繁殖飼養(yǎng)。比如，華北制藥廠定向培育成了虎皮貓[23]；自2003年大連醫(yī)科大學(xué)也開(kāi)始了貓的飼養(yǎng)繁育[24]。在對(duì)實(shí)驗(yàn)用貓進(jìn)行專門飼養(yǎng)時(shí)，我們有必要對(duì)貓的遺傳方面進(jìn)行一定的檢測(cè)。這樣才能合理利用貓資源，為培育實(shí)用的實(shí)驗(yàn)貓群體提供科學(xué)的依據(jù)。本文主要就生化標(biāo)記和DNA分子標(biāo)記在貓的遺傳檢測(cè)中的現(xiàn)狀以及存在的問(wèn)題進(jìn)行了探討。

1 生化標(biāo)記

生化標(biāo)記是以生物在蛋白質(zhì)水平上表現(xiàn)出的遺傳多態(tài)性為依據(jù)，分析群體的遺傳結(jié)構(gòu)，進(jìn)而反映生物的變異程度。此方法的特點(diǎn)是操作簡(jiǎn)單、成本低，方法成熟穩(wěn)定。我國(guó)已將近交系大、小鼠的生化標(biāo)記檢測(cè)作為常規(guī)監(jiān)測(cè)列入國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。

關(guān)于貓的生化標(biāo)記研究最早始于Thuline等[25]，觀察到 6-PGD(六磷酸葡萄糖脫氫酶)呈現(xiàn)多態(tài)性，并且Kohn和Tamarin[26]驗(yàn)證了Thuline的研究結(jié)果。隨后的科學(xué)研究發(fā)現(xiàn)：GPI(磷酸葡萄糖異構(gòu)酶)、ESD(酯酶D)在某些品種貓中也具有多態(tài)性[27-29]。Altunok等[30]從Van cats和其他品種貓的對(duì)比分析中得到：Van cats的平均雜合度為0.33～0.49；并依據(jù)系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)的結(jié)果得出，該貓與暹羅貓、孟買貓存在明顯不同；6-PGD、ME(蘋(píng)果酸酶)和ESD在該研究的全部貓中均呈現(xiàn)多態(tài)性，其中PGD的多態(tài)性最強(qiáng)，而ME是該研究最新發(fā)現(xiàn)的多態(tài)性蛋白。

從上述研究現(xiàn)狀看，在用生化標(biāo)記分析貓的遺傳多態(tài)性時(shí)，其多態(tài)性位點(diǎn)極其有限，易受發(fā)育狀況、實(shí)驗(yàn)條件等影響，限制了其在貓中的應(yīng)用。很有必要開(kāi)發(fā)其他方法分析貓的遺傳多態(tài)性。

2 DNA分子標(biāo)記

DNA多態(tài)性是指不同物種或者同一物種不同個(gè)體間核苷酸序列的變異，在自然界中廣泛存在。以生物個(gè)體之間的DNA差異為標(biāo)記，即分子生物學(xué)標(biāo)記(簡(jiǎn)稱分子標(biāo)記)。目前，發(fā)現(xiàn)的DNA多態(tài)性包括限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(restriction fragment length polymorphism, RFLP)、微衛(wèi)星DNA(microsatellite DNA, STR)、單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms, SNPs)。分子標(biāo)記已成了近年現(xiàn)代遺傳標(biāo)記學(xué)發(fā)展最快的領(lǐng)域之一。對(duì)DNA多態(tài)性的研究，讓我們更加精確直接地分析群體的遺傳多態(tài)性，同時(shí)彌補(bǔ)了蛋白質(zhì)多態(tài)性位點(diǎn)不足的缺點(diǎn)。該研究為生物的物種鑒別、群體多態(tài)性分析、遺傳圖譜構(gòu)建開(kāi)辟了一條嶄新的道路。下文對(duì)幾種DNA多態(tài)性的研究現(xiàn)狀進(jìn)行了綜述。

2.1 限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性

20世紀(jì)80年代初人們便開(kāi)始了RFLP的研究，該技術(shù)以DNA-DNA為基礎(chǔ)的Southem雜交為依托，是遺傳檢測(cè)早期應(yīng)用比較多的方法。Suzuki等[31]用12種限制內(nèi)切酶分析了西表山貓和豹貓的rDNA，與西表山貓屬于西表島本土貓的假說(shuō)不同，他認(rèn)為豹貓是從陸地遷至島上的亞種，與Masuda等[32]的觀點(diǎn)一致。Yuhki和O'brien[33]利用鼠和人的分子探針對(duì)貓的MHC基因(即FLA)進(jìn)行內(nèi)切酶分析，成功繪制了貓B2染色體上的FLA遺傳圖譜。Kuwahara等借助PCR-RFLP將貓F(tuán)LA中的DRB基因進(jìn)行了分型，并以此作為參考標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行貓的皮膚移植實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)DRB分型對(duì)貓移植免疫反應(yīng)，自身免疫的易感性等研究具有重要的參考意義[34-35]。RFLP技術(shù)的多態(tài)性位點(diǎn)豐富、重復(fù)性好且穩(wěn)定性強(qiáng)，是進(jìn)行群體遺傳多態(tài)性分析的有效工具，但操作繁瑣、需要的樣本量大等缺點(diǎn)制約了它的應(yīng)用。

2.2 微衛(wèi)星多態(tài)性

微衛(wèi)星DNA(microsatellite DNA)又稱為短串聯(lián)重復(fù)序列(short tandem repeat, STR)由核心序列和兩側(cè)保守的側(cè)翼序列兩部分組成。在微衛(wèi)星中存在的短串聯(lián)重復(fù)序列(一般重復(fù)單位為1～6 bp)構(gòu)成了核心序列部分，這是STR具有高度多態(tài)性的遺傳基礎(chǔ)；而兩側(cè)保守的側(cè)翼序列將STR特異性地定位于染色體的固定位置，從而使STR多態(tài)性用于遺傳多態(tài)性分析具有可行性。有關(guān)微衛(wèi)星的報(bào)道最早見(jiàn)于1974年Skinner等[36]對(duì)寄居蟹基因組的研究?？茖W(xué)家們之后的發(fā)現(xiàn)表明，微衛(wèi)星DNA在真核生物基因組中廣泛存在，并且?guī)缀醴植加谌旧w的所有區(qū)域。除此之外，STR呈現(xiàn)豐富的DNA多態(tài)性，遵循孟德?tīng)柟诧@性遺傳，在相關(guān)的物種間具有一定的通用性和保守性。進(jìn)而，微衛(wèi)星DNA在犬，牛，馬，貓等[37-40]動(dòng)物的科學(xué)研究中得到了廣泛應(yīng)用。

Menotti-Raymond等[41]篩選了11個(gè)STR(四核苷酸重復(fù)，彼此無(wú)連鎖關(guān)系，并呈現(xiàn)高度的雜合性)用于識(shí)別貓個(gè)體，鑒定親子關(guān)系。Coomber等[42]認(rèn)為這組STR體系在法醫(yī)鑒定中具有很好的穩(wěn)定性和可信度。Lyons等[43]在貓B1染色體上找到了8個(gè)與虎斑毛色連鎖的STR位點(diǎn)，其中，F(xiàn)CA700的連鎖性最強(qiáng)。Filler等[44]采用38個(gè)STR位點(diǎn)，對(duì)塞絲克貓群體的觀測(cè)雜合度(Ho)、期望雜合度He、近交系數(shù)(FIS)等進(jìn)行了遺傳分析。Filler等認(rèn)為，賽絲克貓屬于波斯貓品系家族，且該種群的遺傳多態(tài)性豐富。微衛(wèi)星遺傳標(biāo)記的另一個(gè)重要用途即是：貓品系分類。Lipinski等[3]通過(guò)38個(gè)STR(兩個(gè)四核苷酸重復(fù)，36個(gè)二核苷酸重復(fù))將所研究的貓分成了20個(gè)品系；但鑒于該組STR體系分析另外四個(gè)種群時(shí)缺乏充足的證據(jù)，因此本次實(shí)驗(yàn)有四個(gè)種群并未進(jìn)行品系劃分。而Menotti-Raymond[45]用11個(gè)四核苷酸重復(fù)的STR將1 040只貓分成了17個(gè)品系，仍有20個(gè)種群因證據(jù)不足無(wú)法進(jìn)行品系劃分。不難發(fā)現(xiàn)，四核苷酸重復(fù)的STR沒(méi)有二核苷酸重復(fù)的STR區(qū)分品系的效果好。近年來(lái)對(duì)STR的科學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，用微衛(wèi)星多態(tài)性分析遺傳多態(tài)性是一種比較理想的方法，檢測(cè)方法方便、省時(shí)，但微衛(wèi)星DNA篩選和檢測(cè)的復(fù)雜過(guò)程是研究中很大的制約因素。

2.3 單核苷酸多態(tài)性

單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms, SNPs)是繼RFLP、STR之后的第三代DNA遺傳標(biāo)記。與之前研究的RFLP、STR不同，SNP不再憑借DNA片段的長(zhǎng)度差異反應(yīng)DNA的多態(tài)性，而是根據(jù)基因組水平上單個(gè)核苷酸的變異表述DNA的多態(tài)性。SNP是一種二等位基因標(biāo)記，在群體中只有兩個(gè)等位基因的基因，所以可通過(guò)簡(jiǎn)單的“+/-”進(jìn)行基因分型，更易于實(shí)現(xiàn)其在檢測(cè)、分析中的自動(dòng)化。另外，它的分布密度以及數(shù)量都多于STR、遺傳穩(wěn)定性強(qiáng)并具有代表性，從而可以得到更全面、詳細(xì)的全基因掃描數(shù)據(jù)[46]。目前對(duì)SNP的研究仍處于探索階段，其應(yīng)用范圍主要集中于法醫(yī)、疾病和群體遺傳學(xué)等方面。

Sato等[47]借助不同動(dòng)物毛發(fā)的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)以及動(dòng)物的SNP多態(tài)性對(duì)不同的動(dòng)物進(jìn)行區(qū)分，為法醫(yī)鑒定和瀕危物種的保護(hù)提供了新的思路。Peterschmitt等[48]在研究挪威森林貓時(shí)，發(fā)現(xiàn)了一個(gè)與琥珀毛色連鎖的SNP。家貓對(duì)歐洲野貓的基因滲入問(wèn)題一直備受關(guān)注。曾有研究用STR對(duì)家貓和野貓的遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行了對(duì)比分析，但STR在分辨它們的雜交后代時(shí)存在局限性[49-51]。Nussberger等[52]利用48個(gè)SNP(Fst>0.8)分析了家貓，野貓以及它們的雜種、回交后代的遺傳結(jié)構(gòu)。篩選的48個(gè)STR能有效地區(qū)分雜交的F1，F(xiàn)2代；并且對(duì)評(píng)價(jià)野貓的基因滲入率，理解雜交過(guò)程均有幫助。Mullikin等[17]繪制了高密度的SNP圖譜，并發(fā)現(xiàn)了94個(gè)新的SNPs。

從近年對(duì)SNP的研究情況來(lái)看，有些SNP的檢測(cè)方法成本低、但速度慢、不適合自動(dòng)化分析；有些方法可實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化高通量檢測(cè)、但制備探針昂貴、準(zhǔn)確度不高。綜上所述，目前我們距離靈敏準(zhǔn)確、高通量、簡(jiǎn)單易行的SNP檢測(cè)方法仍有一段距離要努力探索。

3 結(jié)語(yǔ)

貓?jiān)谏镝t(yī)學(xué)研究，制藥業(yè)等研究領(lǐng)域具有舉足輕重的分量。而貓的質(zhì)量對(duì)研究結(jié)果的準(zhǔn)確性，重復(fù)性以及科學(xué)性有著重要的影響。在控制實(shí)驗(yàn)用貓質(zhì)量方面，遺傳質(zhì)量是最主要，最為本質(zhì)性的影響因素。定期開(kāi)展貓的遺傳質(zhì)量檢測(cè)，可有效避免實(shí)驗(yàn)用貓的種質(zhì)退化、遺傳漂移，減少實(shí)驗(yàn)結(jié)果誤差，指導(dǎo)群體的遺傳育種，最大程度地應(yīng)用貓資源。經(jīng)歷了50多年的發(fā)展歷程，有關(guān)貓的遺傳質(zhì)量檢測(cè)已從染色體水平提升到了DNA分子水平[16]。目前，國(guó)外開(kāi)發(fā)了很多分析貓遺傳性疾病和性狀(比如毛色)的遺傳檢測(cè)方法，為貓的育種工作者和獸醫(yī)提供了有效的指導(dǎo)意見(jiàn)。比如，賓夕法尼亞大學(xué)等[13]研究機(jī)構(gòu)已將貓的遺傳檢測(cè)實(shí)現(xiàn)了商業(yè)化應(yīng)用。但我國(guó)目前尚未出臺(tái)實(shí)驗(yàn)用貓遺傳質(zhì)量的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，各地方也沒(méi)有成熟的實(shí)驗(yàn)用貓遺傳質(zhì)量地方標(biāo)準(zhǔn)。隨著國(guó)內(nèi)大專院校，藥品生產(chǎn)企業(yè)以及檢定機(jī)構(gòu)對(duì)實(shí)驗(yàn)用貓使用量的增加，建立符合我國(guó)目前研究水平和應(yīng)用要求的實(shí)驗(yàn)用貓遺傳質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和遺傳質(zhì)量檢測(cè)方法勢(shì)在必行。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，相信我國(guó)對(duì)貓遺傳結(jié)構(gòu)的檢測(cè)分析將會(huì)更加完善，更多更有效的分子標(biāo)記技術(shù)將會(huì)應(yīng)用于貓的遺傳質(zhì)量檢測(cè)中。