涂榮會 綜述，蒙健軍 審校

(廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院:1.心血管病研究所；2.老年病學(xué)科,南寧 530021)

再灌注療法是治療急性心肌梗死最有效的方法，但會引起心臟再灌注損傷，嚴重影響再灌注的療效及患者的預(yù)后。缺血預(yù)處理和缺血后處理是缺血心肌有效的內(nèi)源性保護現(xiàn)象，具有顯著的抗缺血再灌注損傷作用。

天然免疫系統(tǒng)的激活和炎性反應(yīng)是缺血再灌注損傷的重要特征，其在心肌缺血再灌注損傷(myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI)中的重要作用日益受到關(guān)注[1]。本文就天然免疫系統(tǒng)在MIRI及其保護作用的研究進展予以綜述。

1 心臟缺血再灌注損傷

1960年JENNINGS短暫夾閉犬冠狀動脈后再開通，發(fā)現(xiàn)犬更易發(fā)生致命性心室顫動，顯著增加缺血犬的死亡率，首次提出MIRI理念。隨后大量的動物實驗和臨床研究進一步證實，再灌注在改善心肌缺血的同時其本身也會加重心肌細胞損傷，出現(xiàn)心肌梗死面積擴大、惡性室性心律失常、心臟收縮功能減低等再灌注損傷[2]。近年來，隨著溶栓療法、經(jīng)皮冠狀動脈介入術(shù)及冠狀動脈旁路搭橋術(shù)等冠狀動脈血運重建技術(shù)廣泛應(yīng)用于冠心病治療，MIRI越來越引起學(xué)者的關(guān)注，已經(jīng)成為心血管研究的熱點。MIRI是一種復(fù)雜的病理生理過程，其發(fā)生機制尚不完全清楚，主要涉及氧化應(yīng)激、免疫炎性反應(yīng)及白細胞浸潤等。其中，天然免疫系統(tǒng)的激活和炎性反應(yīng)是缺血再灌注損傷的重要特征，其在缺血再灌注損傷中的重要作用日益受到關(guān)注。

2 天然免疫系統(tǒng)與心臟

所有多細胞動物均擁有天然免疫系統(tǒng)。天然免疫系統(tǒng)通過特殊的模式識別受體(pattern recognition receptors，PRRs)識別入侵的病原體，并通過一系列信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，啟動宿主免疫防御反應(yīng)，是機體抵抗病原微生物感染的第一道防線。適度的天然免疫反應(yīng)可促進機體組織修復(fù)，但過度的天然免疫反應(yīng)則會加重機體組織損傷。天然免疫系統(tǒng)中能夠識別病原分子模式的受體包括Toll樣受體(toll-like receptors，TLRs)、補體和天然抗體。

心臟具有完整的先天免疫系統(tǒng)。研究證實，心肌細胞不僅具有舒縮功能，而且類似于體內(nèi)的先天性免疫細胞，也能夠參與機體的天然免疫應(yīng)答反應(yīng)。心肌細胞表面存在TLRs、補體等多種PRRs，當機體遭受缺血再灌注損傷及全身炎癥時，心肌細胞通過激活TLRs信號通路及補體，促進一些炎癥因子表達，啟動和介導(dǎo)局部的炎性反應(yīng)，導(dǎo)致心臟損傷。

3 TLRs與心臟缺血再灌注損傷及保護作用研究

3.1TLRs結(jié)構(gòu)及生物學(xué)功能 TLRs是最早被人類認識的PRRs，屬于Ⅰ型跨膜蛋白，主要由富含亮氨酸重復(fù)序列的膜外區(qū)(識別并結(jié)合病原相關(guān)分子)、跨膜區(qū)和含有Toll/白細胞介素1受體同源區(qū)(Toll/IL-1 receptor homologous region,TIR)結(jié)構(gòu)域的胞質(zhì)區(qū)(介導(dǎo)下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo))組成。TLRs廣泛分布于各種免疫及非免疫細胞之中，主要在心臟、肝臟、胰腺、皮膚、肺及腦等組織中高表達。除識別、結(jié)合來源于病原體的外源性分子以外，TLRs也能識別、結(jié)合由損傷組織和壞死細胞釋放的內(nèi)源性損傷相關(guān)分子，如熱休克蛋白，通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)啟動天然免疫應(yīng)答，介導(dǎo)炎性反應(yīng)[3]。目前在人類中發(fā)現(xiàn)有11種TLRs(TLR1～10、TLR14)，不同的TLRs識別不同的病原分子模式和自身組織分子。依據(jù)含TIR結(jié)構(gòu)域接頭蛋白的不同，TLRs信號通路分為髓樣分化蛋白88(myeloid differential protein-88，MyD88)依賴性和非MyD88依賴性兩條途徑進行細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。不同TLR，接頭蛋白不同，其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路也有差異。除TLR3外，其他TLRs均可通過MyD88依賴性信號通路活化核因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)、胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK)、絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)及p38等信號通路，促進炎性因子生成和釋放；TLR3和TLR4 則介導(dǎo)Toll樣受體轉(zhuǎn)接蛋白通過非MyD88依賴性信號通路，激活干擾素β調(diào)節(jié)因子3和NF-κB，誘導(dǎo)Ⅰ型干擾素、各種炎性因子和共刺激分子的產(chǎn)生、釋放[4]。

3.2TLRs與心臟缺血再灌注損傷 心肌缺血缺氧可引起大量損傷相關(guān)分子釋放，誘導(dǎo)細胞和組織損傷；盡管再灌注維持了心臟的代謝、結(jié)構(gòu)和功能，同時也引起了心臟急性炎性反應(yīng)，進一步加重心肌損傷，在此過程中TLRs作為許多損傷相關(guān)分子的靶點，發(fā)揮了重要作用。其中，TLR4和TLR2介導(dǎo)的信號通路在MIRI中起著關(guān)鍵性調(diào)節(jié)作用。LU等[5]研究發(fā)現(xiàn)，在心臟缺血再灌注早期，心肌缺血區(qū)及危險區(qū)的TLR4及NF-κB表達顯著升高，心肌細胞凋亡明顯增加；而缺血再灌注TLR4基因缺陷小鼠，其心臟炎性反應(yīng)及心肌梗死面積均顯著減少。此外，研究還發(fā)現(xiàn)抑制TLR4及下游信號通路MyD88及NF-κB也能減輕MIRI，進一步證實TLR4/MyD88/NF-κB信號通路參與了MIRI的發(fā)生、發(fā)展[6-7]。BAGCHI等[8]則發(fā)現(xiàn)，除TLR4外，TLR2在大鼠MIRI過程中也明顯升高，通過促進左室重構(gòu)引起心臟結(jié)構(gòu)及功能異常。ARSLAN等[9]在小鼠心臟再灌注前5 min應(yīng)用特異性TLR2抗體，小鼠心肌梗死面積顯著減小，心臟功能顯著改善，則進一步揭示TLR2信號通路介導(dǎo)了MIRI。近年來，TLR9介導(dǎo)的p38 MAPK信號通路在MIRI中的作用已引起學(xué)者的關(guān)注。XIE等[10]發(fā)現(xiàn)再灌注大鼠心肌TLR9及p38 MAPK蛋白表達顯著上調(diào)，心肌細胞凋亡及心肌梗死面積顯著增加，而應(yīng)用TLR9抑制劑氯喹則取消了上述作用，顯示TLR9介導(dǎo)了MIRI?？傊?，TLRs是MIRI的重要受體，其信號通路激活所介導(dǎo)的炎性反應(yīng)及心肌細胞凋亡是MIRI的重要機制，積極干預(yù)TLRs信號通路可能是減輕MIRI新靶點。

3.3TLRs與心臟缺血預(yù)處理 心臟缺血預(yù)處理即心臟經(jīng)過數(shù)次短暫的缺血再灌注處理可改善其后長時間冠狀動脈閉塞引起的心肌損傷，是機體組織自身對抗缺血再灌注損傷的一種強而有效內(nèi)源性保護措施，在冠心病防治、心臟保存及心臟移植等方面具有重要意義。TLRs信號通路在缺血預(yù)處理心臟保護中的重要作用已得到廣泛研究。ZHOU等[11]研究發(fā)現(xiàn)，TLR-9配體(CpG-ODN)預(yù)處理通過抑制心肌細胞能量代謝、促進心肌血管生成，進而改善急性心肌梗死小鼠的心功能。DONG等[12]研究顯示缺血預(yù)處理顯著改善再灌注野生型小鼠的心功能，減少損傷性肌酸激酶的釋放，這種保護作用在LR2及TIR適配蛋白(TIRAP)基因缺陷小鼠消失，提示TLR2-TIRAP信號通路介導(dǎo)心臟缺血預(yù)處理。同樣，應(yīng)用TLR2配體(Pam3CSK4)預(yù)處理能夠顯著減輕小鼠缺血區(qū)中性粒細胞浸潤、炎癥因子產(chǎn)生及心肌細胞凋亡，同時降低血清肌鈣蛋白T水平,減小心肌梗死面積、改善心臟功能。進一步研究顯示，磷脂酰肌醇3激酶一蛋白激酶B(phosphatidylinositol 3-kinase and protein kinase B，PI3K/Akt)生存通路介導(dǎo)了缺血預(yù)處理心臟保護[13]。最近LEE等[14]發(fā)現(xiàn)TLR4信號通路同樣在缺血預(yù)處理心臟保護中發(fā)揮重要調(diào)控作用。應(yīng)用TLR-4 拮抗劑eritoran預(yù)處理，小鼠NF-κB的活化、促炎因子的表達明顯減少，小鼠心肌梗死面積顯著減小。信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制研究顯示缺血預(yù)處理及遠端缺血預(yù)處理通過抑制TLR4/MyD88/NF-κB信號通路改善MIRI[15]。此外，研究還發(fā)現(xiàn)地塞米松預(yù)處理，紫檀芪預(yù)處理也是通過下調(diào)TLR4/MyD88/NF-κB信號通路發(fā)揮心臟保護作用的[16-17]。因此，針對TLRs及下游信號通路積極干預(yù)對缺血預(yù)處理心臟保護具有重要臨床意義。

3.4TLRs與心臟缺血后處理 由于心肌缺血事件的不可預(yù)料性，缺血預(yù)處理的臨床應(yīng)用有一定的局限性。2003年有研究首次提出了一種新的內(nèi)源性心肌保護方法——缺血后處理，即心肌發(fā)生缺血后在長時間的再灌注前對缺血心肌反復(fù)實施短暫的缺血再灌注處理，可以顯著減輕MIRI。大量的基礎(chǔ)研究及臨床試驗均證實缺血后處理可顯著減少再灌注心肌梗死面積及惡性心律失常的發(fā)生，減少心肌壞死與凋亡，顯著改善心臟功能[18]。由于可在缺血后再灌注期間進行，缺血后處理具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。TLR信號通路是否參與心臟缺血后處理目前少有研究報道。近期，KIM等[19]研究顯示TLR9配體后處理通過激活TLR9發(fā)揮心臟保護作用，而應(yīng)用PI3K特異性抑制劑渥曼青霉素，小鼠心肌梗死面積顯著增加，提示這種心臟保護作用是由TLR9-PI3K信號通路介導(dǎo)的。ZHANG等[15]報道七氟烷后處理通過抑制TLR4/MyD88/NF-κB信號通路改善MIRI。而TLR2、TLR3等其他TLRs信號通路在心臟缺血后處理中的重要作用有待進一步研究。

4 補體系統(tǒng)激活與MIRI及保護作用研究

4.1補體系統(tǒng)激活與MIRI 補體是存在于人和動物血清、組織液和細胞膜表面的一組不耐熱、經(jīng)活化后具有酶活性、可介導(dǎo)免疫應(yīng)答和炎性反應(yīng)的蛋白質(zhì)。補體系統(tǒng)由固有成分(C1～C9、B因子、D因子、甘露聚糖結(jié)合凝集素)、調(diào)控蛋白(血漿可溶性因子及細胞膜結(jié)合蛋白)和受體等30余種蛋白質(zhì)組成。作為天然免疫系統(tǒng)的一部分，補體系統(tǒng)不僅通過病原相關(guān)分子模式激活，也可通過缺血再灌注期間釋放的內(nèi)源性損傷相關(guān)分子所激活，通過經(jīng)典途徑、甘露糖結(jié)合凝集素途徑和旁路途徑，最終導(dǎo)致C3的降解和C5的激活，形成攻膜復(fù)合體[1]。攻膜復(fù)合體插入細胞膜形成貫通胞膜的圓形親水離子通道，引起鈉、鈣離子和水分子內(nèi)流，導(dǎo)致細胞鈣超載，最終引起細胞腫脹、裂解死亡；同時攻膜復(fù)合體可刺激內(nèi)皮細胞表達IL、血小板活化因子、P選擇素及單核細胞趨化蛋白-1，引起中性粒細胞、單核巨噬細胞募集到損傷心肌介導(dǎo)炎癥損傷；此外，攻膜復(fù)合體和C5a也可通過誘導(dǎo)p21蛋白(ras基因家族編碼的蛋白質(zhì))的表達引起細胞凋亡；更為重要的是在補體激活過程中產(chǎn)生的補體活性成分及其一系列C3a、C5a等裂解片段，通過促進中性粒細胞、淋巴細胞和單核細胞募集到損傷心肌，產(chǎn)生氧自由基、各種蛋白水解酶，促進炎癥介質(zhì)腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、IL-1、IL-6、NF-κB等釋放，引起心肌細胞的壞死和凋亡，導(dǎo)致心肌損傷。

早在1971年HILL等提出，補體系統(tǒng)在MIRI中發(fā)揮重要的調(diào)控作用，其中C5、C3是引起心肌細胞凋亡及組織損傷的關(guān)鍵介質(zhì)[20]。研究表明，MIRI后C5aR mRNA 和蛋白表達明顯上調(diào)。再灌注C5aR基因敲除的小鼠其心肌組織C3沉積和白細胞浸潤明顯減少，同時心肌細胞凋亡及心肌梗死面積顯著減少，心功能顯著改善[21]。同樣，抑制心肌組織C3沉積及蛋白表達，亦可改善小鼠MIRI[22]。除C5、C3外，補體B因子在MIRI中的作用日益受到關(guān)注。研究顯示，心肌缺血再灌注過程中可激活補體B因子，進而促進心肌C3活化，引起肌鈣蛋白I釋放，心肌梗死面積擴大；而缺血再灌注補體B因子基因缺陷的小鼠，其心肌C3活化和肌鈣蛋白I釋放顯著減少，心肌梗死面積顯著縮小[23]?？傊?，補體與MIRI密不可分，MIRI能夠上調(diào)一些補體成分的表達并導(dǎo)致補體的激活，而激活的補體成分通過直接和間接效應(yīng)介導(dǎo)MIRI。

4.2補體系統(tǒng)與心臟缺血預(yù)處理 2000年，TANHEHCO等發(fā)現(xiàn)缺血預(yù)處理通過減少兔心臟缺血區(qū)C1、C3、C8、C9及攻膜復(fù)合體的mRNA及蛋白質(zhì)表達減輕MIRI，初步證實心臟缺血預(yù)處理通過抑制補體系統(tǒng)激活發(fā)揮再灌注心臟保護作用。在小鼠缺血前30 min分別應(yīng)用C5的單克隆抗體(BB5．1)和C3a 受體拮抗劑 (C3aRA)，再灌注心肌的炎性反應(yīng)及組織損傷明顯減輕。最近，TANG等[24]應(yīng)用C5 shRNA預(yù)處理大鼠，發(fā)現(xiàn)大鼠損傷性血肌鈣蛋白T顯著減少，心肌組織TNF-α等炎癥因子水平顯著下降，同時心肌梗死面積明顯減少40%，進一步研究發(fā)現(xiàn)該保護作用是由PI3K/Akt生存通路介導(dǎo)的。

4.3補體系統(tǒng)與心臟缺血后處理 心臟缺血后處理對補體系統(tǒng)調(diào)控鮮見研究報道。近期臨床試驗顯示，對行冠脈旁路搭橋術(shù)的急性ST段抬高型心肌梗死患者應(yīng)用C1、C5抑制劑，即C1、C5抑制劑后處理，不僅安全，而且有效減輕MIRI，改善心功能。本課題組近期發(fā)現(xiàn)心臟缺血后處理顯著減少缺血再灌注大鼠全身炎性反應(yīng)及心臟C3、C5的mRNA和蛋白表達，通過調(diào)控心臟天然免疫系統(tǒng)，減輕MIRI，具體機制有待深入研究。

5 結(jié) 語

TLRs一直是免疫學(xué)研究的熱點，盡管動物實驗和體外研究已經(jīng)證實，抑制不同TLRs信號通路可有效保護MIRI，然而針對心肌梗死患者抑制TLRs是否能夠挽救心肌進一步損傷目前尚無研究報道。在臨床試驗進行前，進一步闡明不同TLRs介導(dǎo)的MIRI機制是未來的一個重要研究方向。補體系統(tǒng)包括一系列蛋白質(zhì)，針對不同環(huán)節(jié)的補體靶向藥物能在不同水平抑制補體級聯(lián)反應(yīng)，這也提供了許多急性心肌梗死藥物介入靶點。一份納入了4個臨床研究包含5 916份病例的系統(tǒng)回顧顯示，采用新型的C5抑制劑pexelizumab治療，能夠降低急性心肌梗死患者行冠脈搭橋術(shù)的病死率。然而受補體抑制劑發(fā)揮療效的治療窗較窄、組織穿透性差、患者個體差異等多重因素的影響，補體靶向藥物保護性結(jié)果在臨床中可能出現(xiàn)復(fù)雜不一致的現(xiàn)象。針對心肌梗死患者，如何開發(fā)安全有效的補體靶向藥物值得深入研究?？傊琓LRs信號通路及補體激活所介導(dǎo)的天然免疫應(yīng)答是導(dǎo)致MIRI的重要機制。通過對缺血預(yù)處理及缺血后處理抗MIRI的免疫機制深入研究，探討針對TLRs信號通路及補體系統(tǒng)可能的作用靶點，對于缺血預(yù)處理及后處理的臨床應(yīng)用,減輕、預(yù)防MIRI,改善急性心肌梗死患者的心肌存活及長期預(yù)后,具有十分重要的意義。