趙黎君 綜述，劉 芳 審校

(四川大學(xué)華西醫(yī)院腎臟內(nèi)科，成都 610041)

隨著“后基因組學(xué)”時(shí)代的開(kāi)啟，基因組學(xué)功能的研究已成為關(guān)注的焦點(diǎn)，從而也衍生出了一門新的科學(xué)——系統(tǒng)生物學(xué)。系統(tǒng)生物學(xué)有別于既往的發(fā)現(xiàn)生物反應(yīng)中單個(gè)基因或蛋白的分子生物學(xué)研究，它集合了基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)，全面地研究生物系統(tǒng)在生理與病理狀態(tài)下的變化[1]。其中，代謝組學(xué)是一種通過(guò)高通量檢測(cè)技術(shù)、定性或定量的分析組織或生物體液中全部代謝產(chǎn)物的方法[2]。目前已廣泛應(yīng)用于生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)、疾病早期診斷和預(yù)后判斷、藥物或營(yíng)養(yǎng)干預(yù)的作用機(jī)制探討等領(lǐng)域。

糖尿病是導(dǎo)致慢性腎臟疾病(chronic kidney disease,CKD)的主要原因，有30%～40%的糖尿病患者會(huì)出現(xiàn)糖尿病腎病(diabetic nephropathy,DN)[3]，DN已成為導(dǎo)致終末期腎臟病(end-stage renal disease,ESRD)的最主要原因[4]。目前，DN的篩查和分期主要是依據(jù)尿清蛋白及估算腎小球?yàn)V過(guò)率(estimated glomerular filtration rate,eGFR)的聯(lián)合檢測(cè)，而實(shí)際上，DN患者在微量清蛋白尿出現(xiàn)之前就已經(jīng)存在足細(xì)胞損傷、腎小球基底膜增厚等腎臟病理改變；而對(duì)于蛋白尿正常而以eGFR下降為主要表現(xiàn)的DN，腎小球基底膜增厚、系膜增殖乃至K-W結(jié)節(jié)(Kimmelstiel-Wilson nodule)等腎臟病理也早已出現(xiàn)。因此，尿清蛋白，特別是尿微量清蛋白的靈敏度和特異度有限，已經(jīng)不滿足DN的早期診斷。DN作為代謝性疾病慢性微血管并發(fā)癥的代表，采用代謝組學(xué)可以實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)組織、體液中已經(jīng)發(fā)生的小分子代謝產(chǎn)物的變化，從而發(fā)現(xiàn)疾病早期敏感生物標(biāo)志物、判斷疾病預(yù)后、指導(dǎo)藥物開(kāi)發(fā)和療效評(píng)價(jià)、藥物機(jī)制探討等。本文就代謝組學(xué)技術(shù)在DN研究中的最新進(jìn)展進(jìn)行綜述總結(jié)。

1 代謝組學(xué)的研究策略

目前常用的代謝組學(xué)分析工具是核磁共振(nuclear magnetic resonance,NMR)氫譜分析技術(shù)和質(zhì)譜分析技術(shù)。NMR可以對(duì)組織樣本進(jìn)行原位檢測(cè)，同時(shí)具有可重復(fù)性高、無(wú)損傷性的優(yōu)點(diǎn)，但其檢測(cè)的靈敏度低、所能檢測(cè)代謝產(chǎn)物的最低濃度在100 nmol/L～1 μmol/L[5]。質(zhì)譜技術(shù)需要先采用氣相色譜或液相色譜的方法對(duì)生物標(biāo)本內(nèi)待分析的化合物進(jìn)行分離。脂肪酸、氨基酸、生物堿、類固醇可用氣相色譜或液相色譜，核酸、有機(jī)酸等多采用液相色譜，而脂質(zhì)、酯類、類胡蘿卜素等多采用氣相色譜。與NMR技術(shù)相比，氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)具有分析速度更快，靈敏度、分辨率更高的優(yōu)勢(shì)，且其所能檢測(cè)物質(zhì)的最低濃度約1 pmol/L[6]。代謝組學(xué)研究基本流程分為：研究對(duì)象的納入，樣本的收集及預(yù)處理，有機(jī)溶劑進(jìn)行代謝產(chǎn)物的提取和分離，代謝產(chǎn)物的檢測(cè)和原始數(shù)據(jù)的分析，采用生物信息的手段獲得差異代謝產(chǎn)物，并進(jìn)行代謝通路的分析。

2 代謝組學(xué)在DN早期診斷中的應(yīng)用現(xiàn)狀

目前DN的篩查主要是依靠糖尿病患者的病程和尿蛋白的排泄率及eGFR的檢測(cè)。微量清蛋白尿的出現(xiàn)和(或)eGFR下降往往是糖尿病患者腎損害的標(biāo)志物，也是糖尿病患者心血管損害的標(biāo)志物，隨著腎損害的進(jìn)展，可能意味著病變的不可逆轉(zhuǎn)[7]。因此，早期診斷對(duì)于DN患者早期干預(yù)、延緩疾病進(jìn)展尤為重要。DN的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制復(fù)雜，有糖脂代謝紊亂、血流動(dòng)力學(xué)及血液流變學(xué)的異常、基因易感背景、表觀遺傳修飾、炎癥、氧化應(yīng)激等多因素參與[8]。傳統(tǒng)的單一分子生物學(xué)手段是從單因素方面解釋DN發(fā)生機(jī)制，但代謝組學(xué)通過(guò)觀察DN患者、高通量的發(fā)現(xiàn)并驗(yàn)證疾病早期診斷的候選生物標(biāo)志物對(duì)于DN的早期診斷有其優(yōu)勢(shì)。

目前DN早期診斷的生物標(biāo)志物主要有三大類：非酯化脂肪酸(non-esterified fatty acid，NEFAs)、磷脂及氨基酸。NEFAs又稱游離脂肪酸，是血清中未與甘油、膽固醇等酯化的脂肪酸，其來(lái)源主要有儲(chǔ)存于脂肪組織中的三酰甘油被分解釋放入血。正常情況下，血漿NEFAs水平極低，只占總脂肪酸水平的5%～10%，病理性升高的NEFAs有較強(qiáng)的細(xì)胞毒性[9]，且比三酰甘油和血清總膽固醇更能敏感反應(yīng)機(jī)體脂肪代謝變化。SAULNIER等[10]研究分析2型糖尿病導(dǎo)致的DN患者尿液代謝產(chǎn)物與腎臟結(jié)構(gòu)的相關(guān)性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)尿液中短鏈NEFA(2-乙基-3羥基丙酸)與早期糖尿病腎臟內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞相關(guān)。在DN正常蛋白尿期，尿液NEFAs的10-硝基酸就可以明顯升高[11]。在DN的發(fā)生、發(fā)展中，脂代謝紊亂發(fā)揮著重要作用，高水平的NEFAs不僅參與胰島素抵抗，還可作用于系膜細(xì)胞和足細(xì)胞，加重腎間質(zhì)纖維化和蛋白尿[12-13]，尿液中NEFAs水平的升高還可以間接反映CKD腎小管間質(zhì)的損傷[14]。因此，NEFAs與DN患者腎損傷存在密切聯(lián)系，其水平的升高可能提示DN早期病變。

磷脂是細(xì)胞膜脂質(zhì)雙層的關(guān)鍵成分，其與糖尿病、肥胖等代謝性疾病密切相關(guān)[15]。磷脂包括磷脂甘油、磷脂乙醇胺、磷脂酰肌醇、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰膽堿、鞘磷脂和溶血磷脂酰膽堿酶7種亞型。鞘磷脂是足細(xì)胞膜脂閥的結(jié)構(gòu)成分，足細(xì)胞通過(guò)足突包繞相鄰的毛細(xì)血管并形成裂孔膜結(jié)構(gòu)，正常結(jié)構(gòu)的脂閥對(duì)于足細(xì)胞足突對(duì)抗腎小囊內(nèi)張力機(jī)械力、維持腎小球?yàn)V過(guò)屏障的功能至關(guān)重要。LIU等[16]研究發(fā)現(xiàn)與糖尿病組相比，血清中4種鞘磷脂代謝產(chǎn)物(鞘磷脂18∶1/16∶1、神經(jīng)酰胺18∶1/16∶0、葡萄糖神經(jīng)酰胺18∶1/18∶0、鞘氨醇)在微量、大量蛋白尿DN組均明顯升高，且與尿蛋白肌酐比具有明確的相關(guān)性。在DN病理狀態(tài)下，鞘磷脂酰膽堿合成酶(鞘氨酸激酶)的活性升高可以導(dǎo)致足細(xì)胞內(nèi)大量鞘磷脂酰膽堿聚集和脂閥結(jié)構(gòu)異常[17]。動(dòng)物研究中發(fā)現(xiàn)，抑制鞘磷脂酰膽堿的轉(zhuǎn)化可以緩解高脂飲食帶來(lái)的足細(xì)胞Podocin蛋白的丟失、降低蛋白尿[18]?？梢?jiàn)，鞘磷脂不僅與DN有密切關(guān)系，靶向鞘磷脂酰膽堿的藥物還可能延緩DN進(jìn)展。此外，SAULNIER-BLACHE等[19]還發(fā)現(xiàn)2型DN患者尿液中溶血磷脂酰膽堿16∶0、溶血磷脂酰膽堿18∶0、溶血磷脂酰膽堿18∶1和溶血磷脂酰膽堿18∶2明顯升高，而且與尿蛋白水平呈明顯正相關(guān)。

DN患者也存在色氨酸代謝異常[11,20-22]。DEBNATH等[22]研究分析不同CKD分期(包括早期)的2型DN患者血漿色氨酸及其代謝產(chǎn)物變化水平與腎功能的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)血漿色氨酸水平與eGFR水平呈正相關(guān)，而其代謝產(chǎn)物血漿喹啉酸、血漿犬尿氨酸均與eGFR呈負(fù)相關(guān)，這與既往研究報(bào)道一致[21]。NG等[11]研究發(fā)現(xiàn)，尿液中苯丙氨酸和酪氨酸代謝產(chǎn)物羥基苯乙酸、色氨酸代謝產(chǎn)物核糖核酸和吲哚硫酸酚在DN患者尿蛋白正常期就出現(xiàn)升高。色氨酸是一種必需氨基酸，在體內(nèi)吸收后，可合成組織蛋白質(zhì)或分解代謝生成犬尿氨酸、吲哚硫酸酚、5-羥色胺等物質(zhì)。在腎功能不全時(shí)，色氨酸分解代謝過(guò)程中的限速酶活性上調(diào)[23]，導(dǎo)致其分解代謝增加，從而引起血清犬尿氨酸和吲哚硫酸酚水平的升高。研究表明，吲哚硫酸酚可以誘導(dǎo)氧化應(yīng)激[24]，通過(guò)NF-κB途徑促進(jìn)腎小管間質(zhì)纖維化[25]。吲哚硫酸酚主要在腎臟排泄，因此當(dāng)腎功能衰退時(shí)，不能有效將其排出體外，導(dǎo)致吲哚硫酸酚蓄積體內(nèi)。但在DN早期、腎功能處于代償期時(shí)，血清吲哚硫酸酚的升高可能促進(jìn)其代償性排泄，從而檢測(cè)到尿液中吲哚硫酸酚水平升高。

此外，在DN早期還可能出現(xiàn)支鏈氨基酸(亮氨酸、纈氨酸和異亮氨酸)代謝紊亂，血清支鏈氨基酸水平的升高能預(yù)測(cè)胰島素抵抗和糖尿病的發(fā)生[26]。CHUANG等[27]研究發(fā)現(xiàn)，正常、微量和大量蛋白尿的DN患者血清纈氨酸、精氨酸、瓜氨酸、鳥(niǎo)氨酸較健康對(duì)照組升高，而亮氨酸、異亮氨酸、甘氨酸較健康對(duì)照組降低。但王旭方等[28]研究發(fā)現(xiàn)血清纈氨酸、谷氨酰胺和異亮氨酸在DN患者尿清蛋白正常期升高，在蛋白尿期呈下降趨勢(shì)?？赡苁怯捎谠贑KD 4～5期的患者，血清中支鏈氨基酸水平的降低與代謝性酸中毒導(dǎo)致支鏈氨基酸的分解增強(qiáng)有關(guān)[29]，也有報(bào)道支鏈氨基酸可能在其他非CKD患者中出現(xiàn)代謝異常[30]。因此，尚需需更多的基礎(chǔ)研究探索DN和CKD患者支鏈氨基酸代謝機(jī)制的差異，才能更精準(zhǔn)地找到和判別DN早期診斷生物標(biāo)志物。此外，受DN影響的代謝通路還有核酸代謝及三羧酸循環(huán)代謝等。

3 代謝組學(xué)在DN預(yù)后判斷中的應(yīng)用現(xiàn)狀

臨床觀察到，部分DN患者短期內(nèi)進(jìn)展至ESRD，而部分患者病程進(jìn)展較為隱匿，準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)DN患者的預(yù)后有利于推進(jìn)患者的個(gè)體化治療。

TAVARES等[31]一項(xiàng)研究隨訪了56例2型糖尿病伴微量蛋白尿患者出現(xiàn)或不出現(xiàn)腎臟復(fù)合型終點(diǎn)事件的血漿代謝組學(xué)特點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)血漿1,5-脫水山梨糖醇、戊氨酸、天冬氨酸水平與發(fā)生腎臟終點(diǎn)事件有關(guān)。SOLINI等[32]則發(fā)現(xiàn)血漿C-糖化色氨酸、假尿苷、N-乙酰蘇氨酸水平與2型DN患者的eGFR水平下降呈負(fù)相關(guān)。

?；鈮A是細(xì)胞內(nèi)能量代謝所必需的物質(zhì)，由長(zhǎng)鏈脂肪酸和肉堿在細(xì)胞質(zhì)中肉堿棕櫚?；D(zhuǎn)移酶1的作用下合成。?；鈮A經(jīng)酯化后經(jīng)由肉堿?；鈮A載體蛋白作用下跨線粒體膜進(jìn)入線粒體內(nèi)完成脂肪酸β-氧化過(guò)程，生成腺苷三磷酸(ATP)供線粒體和細(xì)胞正常代謝所需。DN患者腎組織存在脂肪酸氧化障礙[33]，血漿?；鈮A水平的異?？梢苑从臣膊〉倪M(jìn)展程度。NIEWCZAS等[34]評(píng)價(jià)了80例2型糖尿病伴CKD 1～3期患者在隨訪8～12年后進(jìn)展為ESRD的風(fēng)險(xiǎn)，研究發(fā)現(xiàn)進(jìn)展為ESRD患者的血漿酰基肉堿類、氨基酸代謝產(chǎn)物水平低于未進(jìn)展為ESRD者，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)酰基肉堿不僅是2型糖尿病發(fā)展為ESRD的潛在生物標(biāo)志物，也在疾病進(jìn)展中發(fā)揮促進(jìn)作用。PENA等[35]隨訪了90例2型糖尿病患者2.5～4.0年，以正常蛋白尿進(jìn)展或不進(jìn)展為微量蛋白尿、微量蛋白尿進(jìn)展或不進(jìn)展為大量蛋白尿進(jìn)行病例-對(duì)照分組研究，探討蛋白尿進(jìn)展的生物指標(biāo)。盡管在正常蛋白尿進(jìn)展或不進(jìn)展為微量蛋白尿的病例-對(duì)照組中沒(méi)有差異血漿和尿液代謝產(chǎn)物，但在微量蛋白尿進(jìn)展或不進(jìn)展為大量蛋白尿組里，血漿丁烯?；鈮A和血漿組氨酸、尿液己糖、尿液谷氨酰胺和尿液酪氨酸水平則和蛋白尿持續(xù)進(jìn)展明顯相關(guān)。

目前，對(duì)1型糖尿病的臨床研究進(jìn)展則較少，NIEWCZAS等[36]隨訪158例1型糖尿病伴CKD 3期患者平均11.5年，發(fā)現(xiàn)有7種血清氨基酸、嘌呤及嘧啶代謝產(chǎn)物與eGFR的下降密切相關(guān)，且均與既往報(bào)道的腎小管損傷標(biāo)志物呈正相關(guān)。

由此可見(jiàn)，脂代謝、氨基酸代謝產(chǎn)物可以作為DN患者疾病預(yù)后判斷的生物標(biāo)志物，應(yīng)用代謝組學(xué)技術(shù)分析可以解釋DN患者進(jìn)展至ESRD的異質(zhì)性，指導(dǎo)臨床醫(yī)生對(duì)DN患者進(jìn)行更為精準(zhǔn)的健康教育和用藥指導(dǎo)。

4 代謝組學(xué)在DN藥物療效及機(jī)制探索的應(yīng)用現(xiàn)狀

代謝組學(xué)在國(guó)內(nèi)中草藥領(lǐng)域的作用是傳統(tǒng)分子生物學(xué)所不能替代的。中國(guó)傳統(tǒng)的中草藥成分復(fù)雜，對(duì)機(jī)體的單個(gè)靶點(diǎn)作用可能并不明顯，大部分藥物的作用機(jī)制還未得到完全的解釋。利用代謝組學(xué)技術(shù)可能發(fā)現(xiàn)其多靶點(diǎn)、多功效的作用機(jī)制[37]。

MEN等[38]采用超高效液相色譜-四級(jí)式飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(UPLC-Q-TOF-MS)技術(shù)分析黃芩對(duì)鏈脲佐菌素(streptozocin,STZ)誘導(dǎo)的DN大鼠的作用，通過(guò)對(duì)比健康對(duì)照組、模型組、藥物干預(yù)組大鼠尿液內(nèi)源性代謝產(chǎn)物的變化，作者發(fā)現(xiàn)色氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、嘌呤、嘧啶和能量代謝等多條通路在模型組出現(xiàn)異常，而經(jīng)黃芩干預(yù)后，以上異常代謝通路均得到逆轉(zhuǎn)。由此可見(jiàn)，代謝組學(xué)可以同時(shí)測(cè)定體內(nèi)多條代謝通路的變化，清晰的區(qū)分模型組和藥物干預(yù)組體液、組織的代謝產(chǎn)物變化，可為闡明復(fù)雜性中草藥的藥理機(jī)制提供證據(jù)和新的思路。

5 代謝組學(xué)與其他組學(xué)結(jié)合在DN中的應(yīng)用現(xiàn)狀

代謝組學(xué)研究的是基因表達(dá)的終產(chǎn)物，通過(guò)生物體內(nèi)代謝物的變化可以反映基因轉(zhuǎn)錄上調(diào)或下調(diào)的效應(yīng)[39]。代謝組學(xué)與其他組學(xué)的結(jié)合將可能更全面地為DN機(jī)制研究提供新的思路。

與載脂蛋白E基因敲除(ApoE-/-)小鼠相比，在STZ聯(lián)合ApoE-/-小鼠尿液中長(zhǎng)鏈酰基肉堿C14∶2-OH水平明顯升高，并且與小鼠腎功能指標(biāo)、腎臟結(jié)構(gòu)具有明顯的相關(guān)性，聯(lián)合腎臟轉(zhuǎn)錄學(xué)分析后發(fā)現(xiàn)參與C14∶2-OH產(chǎn)生的酶及其他參與脂肪酸氧化、氨基酸氧化的酶在STZ聯(lián)合ApoE-/-小鼠中均明顯下調(diào)[40]?？梢?jiàn)，通過(guò)代謝組學(xué)可以高通量發(fā)現(xiàn)明顯變化的代謝產(chǎn)物，結(jié)合轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究則可以進(jìn)一步分析其上游調(diào)節(jié)效應(yīng)。

盡管腎小球病變是DN最早出現(xiàn)異常的部位，但腎小管間質(zhì)的損傷也是早期DN的一種表現(xiàn)。目前對(duì)于腎小管在DN發(fā)生過(guò)程中變化規(guī)律尚缺乏認(rèn)識(shí)。SAS等[41]一項(xiàng)臨床研究利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)聯(lián)合代謝組學(xué)的方法探討了DN發(fā)生進(jìn)展過(guò)程中腎小管的變化。腎組織的轉(zhuǎn)錄組學(xué)富集脂肪酸代謝、糖代謝和三羧酸循環(huán)代謝通路在2型糖尿病患者異常；尿液的代謝組學(xué)結(jié)果也提示三羧酸循環(huán)代謝通路升高。因此，多組學(xué)的聯(lián)合使用可以高通量揭示病變的過(guò)程，也可以更精準(zhǔn)的鎖定疾病的病理、生理過(guò)程中重要的變化信號(hào)通路和分子。

6 展 望

代謝組學(xué)是一門定量分析機(jī)體受到應(yīng)激時(shí)生物體內(nèi)源性代謝產(chǎn)物變化的組學(xué)。DN作為糖尿病的主要并發(fā)癥之一，其發(fā)病過(guò)程中會(huì)伴隨有糖、氨基酸及脂質(zhì)代謝紊亂，發(fā)病機(jī)制錯(cuò)綜復(fù)雜，代謝組學(xué)的高通量、覆蓋面廣的優(yōu)勢(shì)，使得這種研究方法非常適合這類疾病的研究。隨著“后基因組”時(shí)代的飛躍發(fā)展，整合基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)，建立DN的多組學(xué)圖譜，將更全面、深入地揭示DN的發(fā)病機(jī)制，從而為疾病的早期診斷和精準(zhǔn)分子分型及治療提供理論基礎(chǔ)。