陳 妮, 趙 梅, 陳 玲, 韓鵬定

1.海南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院 藥學(xué)部 (海南 570311)；2.海南省第三人民醫(yī)院 藥學(xué)部(海南 572000)

胃癌是中國發(fā)病率較高的胃腸道惡性腫瘤[1]。盡管胃癌已經(jīng)獲得了有效的治療方法，包括胃鏡檢查、全身化療和靶向藥物治療、手術(shù)切除等，但胃癌的預(yù)后仍然較差，數(shù)據(jù)[2]統(tǒng)計，胃癌患者的5年總生存率低于30%。小檗胺是來自小檗屬與黃連屬植物中的一種天然化合物，研究[3-7]發(fā)現(xiàn)，小檗胺對多種不同的癌癥有明顯的抗腫瘤作用。熱療是將腫瘤區(qū)域利用合適的熱源加熱至41～43 ℃并保持一定時間，從而達(dá)到抑制腫瘤作用的一種方法。在臨床上，單純熱療對腫瘤的抑制作用效果不明顯。最新研究[8]發(fā)現(xiàn)，熱療與抗腫瘤藥物聯(lián)合使用，可促進(jìn)抗腫瘤藥物的抗腫瘤效果。本研究通過探討小檗胺聯(lián)合熱療對人胃癌順鉑耐藥細(xì)胞(SGC-7901/DPP)增殖的影響， 研究其潛在的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要材料

胎牛血清和達(dá)爾貝科極限必需培養(yǎng)液(dulbecco minimum essential medium,DMEM)培養(yǎng)液購于Thermo Fisher Scientific公司；四甲基偶氮唑鹽(MTT)試劑以及小檗胺化合物購于Sigma公司；SGC-7901/DPP細(xì)胞株購買于上海中科院細(xì)胞庫；蛋白質(zhì)印跡技術(shù)(Western blot)實驗相關(guān)抗體購于Abcam公司。膜連蛋白 V-異硫氰酸熒光素/碘化丙啶(Annexin V-FITC/PI)凋亡試劑盒購于北京碧云天生物科技有限公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

SGC-7901/DPP細(xì)胞培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)(培養(yǎng)液含有10%的胎牛血清、0.1 U/L青霉素和100 g/L鏈霉素)；培養(yǎng)條件為：細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)(37 ℃，5% CO2)常規(guī)培養(yǎng)。

1.3 細(xì)胞處理

細(xì)胞根據(jù)不同的處理方式分為：1)對照組：SGC-7901/DPP細(xì)胞于培養(yǎng)箱中進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)；2)熱療組: 利用恒溫43 ℃處理SGC-7901/DPP細(xì)胞48 h；3)小檗胺組：利用小檗胺(16 mg/L) 處理SGC-7901/DPP細(xì)胞48 h； 4)小檗胺聯(lián)合熱療組：小檗胺(16 mg/L)聯(lián)合恒溫43 ℃處理SGC-7901/DPP細(xì)胞48 h。

1.4 MTT實驗檢測細(xì)胞增殖能力

SCG-7901/DPP細(xì)胞(1×104個/孔)于96孔板中接種， 培養(yǎng)24 h 后用不同濃度的小檗胺(0～64 mg/L)或者按照1.3分組處理細(xì)胞，于48 h后在96孔板中每孔加入20 μL MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h 后于每孔加入150 μL二甲基亞砜(DMSO)， 在570 nm 波長處測定吸光度A值， 抑制率/%=(570 nmA值：對照組-570 nmA值：實驗組)/570 nmA值：對照組×100%。

1.5 細(xì)胞集落形成試驗檢測細(xì)胞生長能力

細(xì)胞按照1.3分組處理48 h后，SGC-7901/DPP細(xì)胞于6 孔培養(yǎng)板接種，連續(xù)培養(yǎng)10 d，每隔3 d更換1 次培養(yǎng)基，每組3個復(fù)孔。于10 d后， 將細(xì)胞利用75%乙醇固定，然后利用0.5%結(jié)晶紫染色。顯微鏡下觀察拍照，并計算集落數(shù)量。

1.6 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率

細(xì)胞按照1.3分組處理48 h后， 用PBS洗滌SGC-7901/DPP細(xì)胞，將細(xì)胞利用70% 冷乙醇固定后，與RNA 酶反應(yīng)過夜，然后將反應(yīng)的細(xì)胞與碘化丙啶染液混勻后， 細(xì)胞分析采用流式細(xì)胞儀，激發(fā)波長為488 nm，細(xì)胞凋亡率采用Modfit LT 2.0 軟件分析。

1.7 Western blot檢測細(xì)胞中蛋白水平

細(xì)胞按照1.3分組處理48 h后， 利用含有蛋白酶抑制劑(RIPA)緩沖液裂解SGC-7901/DPP細(xì)胞進(jìn)行蛋白的提取。 蛋白濃度的測定采用BCA蛋白濃度測定試劑盒進(jìn)行。 將等量總蛋白(20 g)利用10% SDS-PAGE凝膠電泳， 然后利用半干法將電泳蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，PVDF膜于室溫利用TBST溶液(含有5%脫脂奶粉) 封閉1 h，TBST 洗滌，然后與不同的一抗于4 ℃冰箱孵育過夜。 將冰箱孵育過夜的PVDF膜利用TBST洗滌3 次之后，與辣根果氧化物酶標(biāo)記的二抗于室溫孵育1 h，利用ECL試劑盒曝光顯影。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 小檗胺對SGC-7901/DPP細(xì)胞的增殖影響

利用不同濃度的小檗胺(0～64 mg/L)處理SGC-7901/DPP細(xì)胞48 h 后， MTT實驗檢測SGC-7901/DPP 細(xì)胞活性，發(fā)現(xiàn)小檗胺在16 mg/L時，對SGC-7901/DPP 細(xì)胞增殖抑制達(dá)到了(21.3±3.1)%，隨著濃度的升高，小檗胺對SGC-7901/DPP細(xì)胞增殖的抑制沒有明顯提高，抑制率分別為 (22.5±5.6)%和(23.5±4.5)% 。因此本研究選擇了16 mg/L 小檗胺作為后續(xù)的聯(lián)合熱療實驗(表1)。

表1 小檗胺對SGC-7901/DPP細(xì)胞增殖的影響

2.2 小檗胺聯(lián)合熱療對SGC-7901/DPP細(xì)胞增殖、凋亡的影響

MTT實驗結(jié)果顯示，與對照組相比，單獨熱療處理或者單獨小檗胺 (16 mg/L)處理可抑制SGC-7901/DPP細(xì)胞增殖，抑制率分別為(17.2 ± 4.5)%和(23.3 ± 6.0)%；小檗胺聯(lián)合熱療處理SGC-7901/DPP細(xì)胞可進(jìn)一步抑制細(xì)胞增殖，抑制率為(70.9 ± 7.5)%，與單獨熱療組或者小檗胺組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。集落形成實驗結(jié)果顯示，與對照組相比，單獨熱療處理或者單獨小檗胺 (16 mg/L)處理可以抑制SGC-7901/DPP細(xì)胞的集落形成數(shù)量，抑制率分別為30.3%和37.0%；小檗胺聯(lián)合熱療處理SGC-7901/DPP細(xì)胞可進(jìn)一步抑制細(xì)胞的集落形成數(shù)量，抑制率為72.6%，與單獨熱療組或小檗胺組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。流式細(xì)胞技術(shù)實驗結(jié)果顯示，與對照組相比，單獨熱療處理或者單獨小檗胺 (16 mg/L)處理可以增加SGC-7901/DPP細(xì)胞的凋亡比例，凋亡率增加分別為(21.5±4.5)%和(23.9±5.7)%；與單獨熱療組或者小檗胺組相比，小檗胺聯(lián)合熱療處理SGC-7901/DPP細(xì)胞可以進(jìn)一步增加SGC-7901/DPP細(xì)胞的凋亡比例(P<0.05)(表2)。

表2 小檗胺聯(lián)合熱療對SGC-7901/DPP細(xì)胞增殖、凋亡的影響

注：與對照組比較，*P<0.05；與熱療組比較，#P<0.05，##P<0.01；與小檗胺組比較，&P<0.05,&&P<0.01

2.3 小檗胺聯(lián)合熱療影響SGC-7901/DPP細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平

小檗胺聯(lián)合熱療對SGC-7901/DPP細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的影響利用Western blot檢測，與對照組相比，單獨熱療組和小檗胺組(16 mg/L)處理能夠降低Bcl-2的蛋白水平，同時提高Bax，cleaved caspase-3以及cleaved caspase-9的蛋白水平(P<0.05)。與單獨熱療組或者小檗胺組(16 mg/L)相比，小檗胺聯(lián)合熱療組中 Bcl-2的蛋白水平降低，Bax、cleaved caspase-3和cleaved caspase-9 的蛋白水平明顯提高(P<0.05)(圖1)。

注：A: Western blot 檢測各組SGC-7901/DPP細(xì)胞中Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3和cleaved caspase-9 蛋白的表達(dá)；B: 各組SGC-7901/DPP細(xì)胞中Bcl-2蛋白表達(dá)水平的統(tǒng)計分析；C: 各組SGC-7901/DPP細(xì)胞中Bax蛋白表達(dá)水平的統(tǒng)計分析；D: 各組SGC-7901/DPP細(xì)胞中cleaved caspase-3蛋白表達(dá)水平的統(tǒng)計分析；E：各組SGC-7901/DPP細(xì)胞中cleaved caspase-9蛋白表達(dá)水平的統(tǒng)計分析；1：對照組；2：熱療組；3：小檗胺組；4：小檗胺聯(lián)合熱療組；與對照組比較，*P<0.05；與熱療組比較，#P<0.05；與小檗胺組比較，&P<0.05

2.4 小檗胺聯(lián)合熱療抑制SGC-7901/DPP細(xì)胞耐藥相關(guān)蛋白的表達(dá)水平

小檗胺聯(lián)合熱療對SGC-7901/DPP細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的影響利用Western blot檢測，與對照組相比，單獨熱療組和小檗胺組(16 mg/L)處理能夠明顯降低多藥耐藥基因1(multidrug resistance protein 1， MDR1)以及多藥耐藥相關(guān)蛋白1(multidrug resistance-associated protein 1，MRP1)的蛋白水平(P<0.05)。與單獨熱療組或小檗胺組(16 mg/L)相比，小檗胺聯(lián)合熱療組的MDR1以及MRP1蛋白水平明顯降低(P<0.05)(圖2)。

圖2 小檗胺聯(lián)合熱療抑制SGC-7901/DPP細(xì)胞耐藥相關(guān)蛋白的表達(dá)水平

注：A: Western blot 檢測各組SGC-7901/DPP細(xì)胞中MDR1和MRP1蛋白的表達(dá)；B: 各組SGC-7901/DPP細(xì)胞中MDR1蛋白表達(dá)水平的統(tǒng)計分析；C: 各組SGC-7901/DPP細(xì)胞中MRP1蛋白表達(dá)水平的統(tǒng)計分析；1：對照組；2：熱療組；3：小檗胺組；4：小檗胺聯(lián)合熱療組；與對照組比較，*P<0.05; 與熱療組比較，#P<0.05；與小檗胺組比較，&P<0.05

3 討論

胃癌治療的方法主要包括手術(shù)治療、放射治療和化療。 多藥耐藥(multidrug resistance，MDR)的發(fā)展大大降低了化療的療效， 減輕MDR的發(fā)展可以恢復(fù)癌細(xì)胞對化療的敏感性。 研究[9]發(fā)現(xiàn)，MDR相關(guān)蛋白的表達(dá)在MDR的發(fā)生發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用。在臨床上，熱療作為一種輔助治療腫瘤的手段聯(lián)合化療已經(jīng)收到越來越多的關(guān)注，并且已在相關(guān)腫瘤治療中獲得了應(yīng)用[10]。小檗胺具有免疫保護(hù)功能和活性，如刺激正常造血功能，具有抗炎和抗心律失常等作用[11-13]。雖然有研究[3-7]表明，小檗胺對不同類型的腫瘤有抑制作用，但其對胃癌的作用尚不明確，機(jī)制尚不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)，小檗胺聯(lián)合熱療可以有效抑制SGC-7901/DPP細(xì)胞的增殖，增加SGC-7901/DPP細(xì)胞凋亡，同時抑制MDR1和MRP1的蛋白水平，比單獨熱療或單獨使用小檗胺更有效。

小檗胺可以抑制不同類型腫瘤細(xì)胞的增殖，這種抑制作用可能是通過觸發(fā)凋亡途徑發(fā)揮其抗腫瘤活性，并調(diào)節(jié)參與癌癥進(jìn)展的信號通路。凋亡信號傳導(dǎo)途徑的異常與癌癥發(fā)生有著緊密聯(lián)系。許多抗癌化合物通過激活凋亡途徑發(fā)揮其抗癌作用。在胰腺癌中，小檗堿能夠增加胰腺癌細(xì)胞中的Bax/Bcl-2比例，增強caspase-3和caspase-9的蛋白水平，從而誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞中的細(xì)胞凋亡[4]。Zhang等[5]發(fā)現(xiàn)，小檗胺能夠提高促凋亡Bax蛋白的水平，降低抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-xL的表達(dá)，從而導(dǎo)骨髓瘤細(xì)胞凋亡。 Wang等[14]研究發(fā)現(xiàn)，小檗胺能增加Fas、 p53、caspase-3和caspase-8、caspase-9蛋白的表達(dá)，從而促進(jìn)HepG2細(xì)胞凋亡。最新研究[5]發(fā)現(xiàn)，小檗胺能夠通過抑制Wnt/β-catenin信號通路來抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖，并促進(jìn)其凋亡。Zhang等[7]研究也發(fā)現(xiàn)，小檗胺通過p53依賴機(jī)制促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞的凋亡。本研究中，小檗胺聯(lián)合熱療能夠促進(jìn)SGC-7901/DPP細(xì)胞的凋亡，這種促進(jìn)凋亡作用可能與Bcl-2蛋白水平的降低，以及caspase-3、caspase-9和Bax蛋白水平升高有關(guān)。

MDR是治療癌癥的主要障礙，包括主要導(dǎo)致化療失敗的胃癌治療。MDR1基因編碼屬于ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運蛋白超家族的P-糖蛋白(P-gp)。 P-gp能夠?qū)⒒熕幬镛D(zhuǎn)運出細(xì)胞，導(dǎo)致藥物積聚下降，進(jìn)而導(dǎo)致MDR[15-16]。 MRP1也屬于ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運蛋白超家族，MRP1導(dǎo)致MDR的作用機(jī)制與MDR1相似[17]。本研究中，小檗胺聯(lián)合熱療處理，可降低SGC-7901/DPP細(xì)胞的MDR1以及MRP1蛋白水平，提示小檗胺聯(lián)合熱療抑制SGC-7901/DPP細(xì)胞增殖可能與抑制MDR1以及MRP1蛋白水平有關(guān)。

綜上所述，小檗胺聯(lián)合熱療對SGC-7901/DPP的增殖抑制作用可能通過調(diào)控凋亡相關(guān)蛋白，促進(jìn)SGC-7901/DPP凋亡以及抑制MDR1和MRP1蛋白水平有關(guān)。未來將在以下幾個方面開展研究工作：探索小檗胺聯(lián)合熱療能否降低SGC-7901/DPP的耐藥性；探討小檗胺聯(lián)合熱療對SGC-7901/DPP耐藥性的相關(guān)分子信號通路的影響；進(jìn)一步研究小檗胺聯(lián)合熱療對其他類型的耐藥性癌細(xì)胞增殖的影響；利用動物腫瘤模型進(jìn)一步確認(rèn)小檗胺聯(lián)合熱療的體內(nèi)抗腫瘤活性。