劉子源，孫 綱，曹 群，盧光輝，邵潤東

1.大連醫(yī)科大學(xué)(大連 116021)；2.中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第967醫(yī)院(大連 116021)；3.錦州醫(yī)科大學(xué)(錦州 121000)

TRIM59蛋白屬于TRIM三基序家族的一員，2011 年被證實(shí)是多種癌癥的致癌性基因，其具有1個(gè)ring finger domain、1個(gè)B-box domain、2個(gè)卷曲螺旋和1個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域。目前研究[1-4]發(fā)現(xiàn)TRIM59在肝癌、胃癌、肺癌、結(jié)腸癌、膀胱癌和神經(jīng)膠質(zhì)瘤等多種惡性腫瘤中表達(dá)上調(diào)，其在惡性腫瘤的侵襲、遷移、增殖和凋亡等多過程中也發(fā)揮著重要效應(yīng)。

E-鈣粘蛋白及N-鈣粘蛋白均為經(jīng)典鈣粘蛋白，與腫瘤細(xì)胞成纖維細(xì)胞樣形態(tài)改變相關(guān)，可增加腫瘤細(xì)胞活動(dòng)性，使其更易發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移。研究[5-8]發(fā)現(xiàn)其在肝癌發(fā)生過程中發(fā)揮重要作用。因此，研究TRIM59與E-鈣粘蛋白、N-鈣粘蛋白相關(guān)性可能對早期肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)的診斷和治療提供新的契機(jī)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染

實(shí)驗(yàn)中所需細(xì)胞株購于美國ATCC。Huh7細(xì)胞在DMEM(美國Gibco)中培養(yǎng)。Hep3B、HepG2 和 SK-Hep1細(xì)胞在EMEM (美國Gibco)中培養(yǎng)。 BEL7402、LO2、SMMC7721及RPMI 1640細(xì)胞在培養(yǎng)基(美國Gibco)中培養(yǎng)。所有培養(yǎng)基均添加10%胎牛血清(美國Gibco)和1%青霉素/鏈霉素(中國Beyotime生物研究所)。細(xì)胞在37 ℃，5%CO2的潮濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。預(yù)實(shí)驗(yàn)選擇HCC研究熱點(diǎn)Huh7、Hep3B、HepG2、SK-Hep1、 BEL7402、SMMC7721，增加實(shí)驗(yàn)可靠性，根據(jù)最終實(shí)驗(yàn)結(jié)果選擇進(jìn)一步研究的細(xì)胞。用脂質(zhì)體3000(美國Invitrogen)將質(zhì)粒導(dǎo)入所有細(xì)胞。

1.2 質(zhì)粒和慢病毒

用PCR方法從小鼠E17 Clontech Laboratories 中擴(kuò)增TRIM59。包含TRIM59 cDNA的結(jié)果碎片被亞克隆到pcDNA 3.1載體上。使用慢病毒顆粒直接感染HepG2和Huh7細(xì)胞。隨后用普羅霉素(美國Sigma)選擇穩(wěn)定的克隆。對選擇的細(xì)胞群體進(jìn)行免疫印跡，研究敲除效率(實(shí)驗(yàn)所需抗TRIM59及TRIM59慢病毒結(jié)構(gòu)來自美國Santa Cruz。

1.3 定量實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)

用RNeaseMini試劑盒(德國Qiagen)從細(xì)胞中提取總RNA。TRIM 59和家養(yǎng)基因β-actin的定量實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qRT-PCR) 以10 μL為最終體積進(jìn)行，其中含有5 μL的SsoFastTMEvaGreen超級混合物(美國Bio-Rad 實(shí)驗(yàn)室), 1 μL的cDNA，正反兩對引物各1 mm。TRIM59的引物是5′-tac gag agc agc tgg aa-3′和5′-acg ggt tga acc tca gga ag-3′。β-肌動(dòng)蛋白的引物是5′-agt act ccg tgt gga tc g gc-3′和5′-gct gat cca cat ctg ctg ga-3′。在Applie d Biosystems 7500實(shí)時(shí)PCR循環(huán)儀上進(jìn)行qRT-PCR。目標(biāo)基因的表達(dá)針對housekeeping水平進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。結(jié)果表示TRIM59 mRNA表達(dá)的水平。

1.4 碳酸脂膜實(shí)驗(yàn)

將細(xì)胞懸液(200 μL)以1×105個(gè)細(xì)胞/孔注入涂有Martrigel(中國Corning)的上室中，將含有10%FBS(650 G)的培養(yǎng)基加入下室中。24 h后，用棉簽去除未穿透細(xì)胞。細(xì)胞經(jīng)4%甲醛固定后，用0.1%結(jié)晶紫染色。根據(jù)光學(xué)顯微鏡隨機(jī)選擇區(qū)域中的細(xì)胞總數(shù)定義細(xì)胞的侵襲能力。

1.5 劃痕試驗(yàn)

HepG2和Huh7細(xì)胞以4.0×105個(gè)/mL進(jìn)行接種。24 h后，使用20-μL移液器芯片將匯合的單層細(xì)胞行線性劃痕。使用有照相機(jī)的顯微鏡在刮擦后立即拍攝記錄，48 h時(shí)拍攝劃痕區(qū)域。 數(shù)據(jù)用Image J軟件進(jìn)行分析。

1.6 蛋白質(zhì)印跡法

將來自細(xì)胞系的總蛋白在裂解緩沖液(瑞士Roche)中提取并使用Bradford方法進(jìn)行鑒定。用SDS-PAGE法分離蛋白，轉(zhuǎn)化后，將硝酸纖維素濾膜(NC)膜(中國PALL)與小鼠或兔免疫球蛋白G抗體連同原抗體共同孵育，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)(ECL，美國Bio-Rad實(shí)驗(yàn)室)和GAPDH 結(jié)合的辣根過氧化物酶對照。用校準(zhǔn)的GS-670密度計(jì)測定蛋白質(zhì)條帶的密度量化變化。分別獨(dú)立進(jìn)行3個(gè)實(shí)驗(yàn)過程。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 TRIM59在HCC細(xì)胞的表達(dá)

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)與正常人肝細(xì)胞(LO2)細(xì)胞比較，TRIM59 mRNA表達(dá)水平在各系HCC細(xì)胞系中均為高表達(dá)，其中在Huh7和 HepG2中TRIM59 mRNA表達(dá)水平最明顯。使用蛋白質(zhì)印跡技術(shù)進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，TRIM59的蛋白質(zhì)表達(dá)水平也呈高表達(dá)，特別是在Huh7和 HepG2中表達(dá)水平最為明顯(圖1)。

圖1 TRIM59在HCC細(xì)胞系中上調(diào)

2.2 TRIM59對HCC細(xì)胞遷移和侵襲的影響

使用劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell試驗(yàn)進(jìn)一步評估TRIM59在HCC細(xì)胞遷移和侵襲中的作用。在劃痕試驗(yàn)中，48 h后shControl組中傷口基本為遷移的細(xì)胞所愈合，而TRIM59的敲除則減弱了該傷口的愈合進(jìn)度，TRIM59的過表達(dá)通過HepG2和Huh7細(xì)胞中的劃痕實(shí)驗(yàn)表明TRIM59能促進(jìn)細(xì)胞轉(zhuǎn)移。在Transwell試驗(yàn)中，結(jié)果顯示TRIM59敲除將會(huì)顯著降低侵襲細(xì)胞的數(shù)量，而TRIM59過表達(dá)可增加侵襲細(xì)胞的數(shù)量，進(jìn)而促進(jìn)HepG2和Huh7細(xì)胞的遷移和侵襲能力。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明TRIM59有助于HCC細(xì)胞的遷移和侵襲(圖2)。

圖2 TRIM59對HCC細(xì)胞遷移和侵襲的生物學(xué)功能

注：A、B：劃痕試驗(yàn)。 具有shTRIM 59-1、shTRIM 59-2或shControl(A)的HepG 2及Huh 7細(xì)胞轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-載體或pcDNA3.1-TRIM 59表達(dá)質(zhì)粒(B)將細(xì)胞培養(yǎng)成單層細(xì)胞，刮擦以產(chǎn)生劃痕傷口

2.3 TRIM59對E-鈣粘蛋白、N-鈣粘蛋白表達(dá)的干預(yù)

為研究TRIM59調(diào)節(jié)細(xì)胞遷移和侵襲的分子機(jī)制，采用蛋白質(zhì)印跡法檢測在細(xì)胞轉(zhuǎn)移中起重要作用的E-鈣粘蛋白、N-鈣粘蛋白的表達(dá)水平。TRIM59的敲除顯著降低了E-鈣粘蛋白表達(dá)，同時(shí)增加HepG2和Huh7細(xì)胞中的N-鈣粘蛋白表達(dá)；相反，TRIM59過度表達(dá)會(huì)上調(diào)E-鈣粘蛋白表達(dá)并降低N-鈣粘蛋白的表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)表明TRIM59可能通過干預(yù)E-鈣粘蛋白、N-鈣粘蛋白來調(diào)節(jié)HCC細(xì)胞的轉(zhuǎn)移(圖3～4)。

圖3 TRIM59對HCC細(xì)胞遷移和侵襲的生物學(xué)功能

圖4 TRIM59調(diào)節(jié)E-鈣粘蛋白、N-鈣粘蛋白表達(dá)

注：A：蛋白質(zhì)印跡法分析沉默TRIM59表達(dá)的HepG2和Huh7細(xì)胞系中E-鈣粘蛋白、N-鈣粘蛋白的表達(dá)；B：使用Westernblot分析pcDNA3.1-Vector或pcDNA3.1-TRIM59瞬時(shí)轉(zhuǎn)染時(shí)E-鈣粘蛋白、N-鈣粘蛋白的表達(dá)

3 討論

原發(fā)性肝癌占所有腫瘤的7%，其中90%為HCC[9]。HCC發(fā)病率居世界第5位、病死率居第3位[10]，其中中國HCC病死數(shù)占全球總數(shù)的51%(38．3萬人/年)[11]，且70%新發(fā)病例來自亞洲(50%來自中國)[12]。隨著經(jīng)濟(jì)水平和人民健康意識(shí)的提高及對肝癌普查范圍和強(qiáng)度的擴(kuò)大，中國部分肝癌患者得以早期發(fā)現(xiàn)、早期治療從而改善肝癌的發(fā)病[13]。因此，更好地掌握HCC的微觀分子機(jī)制對于早期診斷干預(yù)HCC具有重要意義。TRIM59可通過多種途徑參與介導(dǎo)腫瘤的發(fā)生與發(fā)展。TRIM59是一種新型生物標(biāo)志物，具有致癌活性，在不同惡性腫瘤中表達(dá)上調(diào)，且與臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及預(yù)后有關(guān)。 TRIM59可通過多種機(jī)制影響腫瘤的增殖、凋亡、侵襲和遷移，如調(diào)控 p53、影響細(xì)胞周期、調(diào)節(jié)EMT途徑、激活 Ras/RB、PI3K/AKT和TGF-β/Smad2/3信號(hào)通路等。但目前對 TRIM59的研究僅限于部分腫瘤， 對其作用機(jī)制研究更少，尤其在化療耐藥、自噬、血管生成等方面。 因此，深入研究 TRIM59在惡性腫瘤中的作用機(jī)制及 TRIM59多態(tài)性在預(yù)測惡性腫瘤風(fēng)險(xiǎn)中的作用，有望為早期診斷治療惡性腫瘤提供新的思路[14]。E-鈣粘蛋白是細(xì)胞間連接的重要構(gòu)成部分，E-鈣粘蛋白通常作為檢測細(xì)胞發(fā)生EMT的首選因子[15]。據(jù)研究報(bào)道，E-鈣粘蛋白在HCC的侵襲及轉(zhuǎn)移中具有重要意義。N-鈣粘蛋白在HCC等多種惡性腫瘤中使得腫瘤細(xì)胞活動(dòng)性增加，從而更容易侵襲和轉(zhuǎn)移。

本實(shí)驗(yàn)研究了TRIM59在HCC細(xì)胞中的生物學(xué)功能。結(jié)果表明，TRIM59及其蛋白質(zhì)表達(dá)產(chǎn)物在HepG2和Huh7細(xì)胞中最為顯著。研究[16]表明，HepG2和Huh7細(xì)胞比其他細(xì)胞系更加敏感。使用shControl，shTRIM59-1或shTRIM59-2慢病毒感染HepG2和Huh7細(xì)胞，通過普羅霉素篩選并經(jīng)過蛋白質(zhì)印跡法驗(yàn)證，TRIM59的表達(dá)量明顯下降，表明TRIM59敲除有效，該結(jié)果符合本實(shí)驗(yàn)?zāi)康?。用pcDNA3.1-Ve ctor或pcDNA3.1-TRIM59表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞和Huh7細(xì)胞，用來研究TRIM59對HCC細(xì)胞遷移和侵襲的生物學(xué)功能。 在劃痕試驗(yàn)中用shTRIM 59-1、shTRIM 59-2或shControl或shControl和HepG 2及Huh 7細(xì)胞穩(wěn)定的HepG 2和Huh 7細(xì)胞將轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-載體或pcDNA3.1-TRIM 59表達(dá)質(zhì)粒的Huh 7細(xì)胞培養(yǎng)成單層細(xì)胞。將單層刮成直線刮擦以產(chǎn)生劃痕傷口。48 h后，shControl組的傷口基本為遷移的細(xì)胞所愈合，TRIM59敲除組減慢了傷口的愈合，TRIM59過表達(dá)組卻促進(jìn)了細(xì)胞遷移和傷口的愈合。在transwel試驗(yàn)中，用pcDNA3.1-Vector或pcDNA3.1-TRIM59表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的shTRIM59-1，shTRIM59-2和shControl以及HepG2和Huh7細(xì)胞的穩(wěn)定HepG2和Huh7細(xì)胞在transwell小室中培養(yǎng)。用Martrigel處理24 h，將細(xì)胞固定，染色并隨機(jī)計(jì)數(shù)，研究發(fā)現(xiàn)TRIM59敲除組顯著降低了侵襲細(xì)胞的數(shù)量；而TRIM59過表達(dá)組卻顯著增加了侵襲細(xì)胞的數(shù)量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明TRIM59有助于HCC細(xì)胞的遷移和侵襲。研究結(jié)果表明TRIM59在肝癌細(xì)胞中高表達(dá)。此外，本研究發(fā)現(xiàn)TRIM59的敲除顯著降低E-鈣粘蛋白表達(dá)，同時(shí)增加HepG2和Huh7細(xì)胞中N-鈣粘蛋白表達(dá)；相反，TRIM59過度表達(dá)會(huì)上調(diào)E-鈣粘蛋白表達(dá)并降低N-鈣粘蛋白的表達(dá)。這些研究表明TRIM59可能通過干預(yù)E-鈣粘蛋白、N-鈣粘蛋白來調(diào)節(jié)HCC細(xì)胞的侵襲及遷移。

綜上所述，本研究結(jié)果表明TRIM59在HCC中的高表達(dá)及TRIM59可促進(jìn)HCC侵襲和遷移的能力。與此同時(shí)，TRIM59可能通過上調(diào)E-鈣粘蛋白表達(dá)并降低N-鈣粘蛋白的表達(dá)來調(diào)節(jié)HCC細(xì)胞的侵襲及遷移。本次研究加深了我們對HCC發(fā)展轉(zhuǎn)移的認(rèn)識(shí)，同時(shí)也可將TRIM59作為HCC治療的一個(gè)潛在的作用靶點(diǎn)。