呂 芾，張華陽(yáng)，黃守娟，向軒頤，鄭 莉，張 曉，張奇蘭

成都醫(yī)學(xué)院(成都 610500)

脊髓損傷屬于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的嚴(yán)重創(chuàng)傷，大部分是由于各種外力作用于脊柱，造成脊髓壓迫或斷裂，常導(dǎo)致不可恢復(fù)的感覺(jué)及運(yùn)動(dòng)功能部分或完全喪失[1]。由于脊髓損傷難以恢復(fù)，常將之視為一種嚴(yán)重的致殘性疾病，其給社會(huì)和家庭帶來(lái)了很大負(fù)擔(dān)。脊髓損傷分為原發(fā)性與繼發(fā)性，脊髓水腫是脊髓損傷后的主要并發(fā)癥之一，是其他繼發(fā)性脊髓損傷的病理學(xué)基礎(chǔ)，可以極大地影響創(chuàng)傷后的恢復(fù)過(guò)程。線(xiàn)粒體功能障礙常為導(dǎo)致細(xì)胞水腫加劇的關(guān)鍵性事件，當(dāng)線(xiàn)粒體能量的產(chǎn)生和利用受到抑制，將進(jìn)一步增加細(xì)胞內(nèi)滲透壓負(fù)荷，加劇細(xì)胞水腫。研究[2-3]發(fā)現(xiàn)，脊髓水腫的形成和消退與水通道蛋白(aquaporins,AQP)表達(dá)水平有關(guān)。而電壓依賴(lài)性陰離子通道(voltage-dependent anion-selective channel protein,VDAC)作為線(xiàn)粒體外膜上的一種陰離子通道蛋白，在線(xiàn)粒體能量代謝過(guò)程中起重要作用。因此，本課題擬探討AQP與VDAC的相互作用關(guān)系，進(jìn)一步從能量代謝角度研究損傷性脊髓水腫的分子生物學(xué)機(jī)制。

AQP家族是一類(lèi)在細(xì)胞膜表達(dá)的特殊通道蛋白，負(fù)責(zé)水和其他小分子運(yùn)輸。目前,AQP已發(fā)現(xiàn)13個(gè)亞型，其中AQP4在大腦和脊髓中分布廣泛，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)調(diào)節(jié)水含量的主要分子途徑[4-5]。AQP4 表達(dá)上調(diào)與中樞神經(jīng)系統(tǒng)膠質(zhì)細(xì)胞的水腫密切相關(guān)，而當(dāng)其表達(dá)下調(diào)時(shí)可以減輕腦和脊髓水腫的程度，進(jìn)而促進(jìn)損傷修復(fù)[6-7]。VDAC家族作為一種線(xiàn)粒體外膜上分子和離子交換出入的通道，對(duì)線(xiàn)粒體與胞質(zhì)之間的物質(zhì)代謝和能量代謝起著十分重要的作用[8]。其中，VDAC2作為其家族成員之一，是線(xiàn)粒體外膜上含量豐富的陰離子通道蛋白，對(duì)線(xiàn)粒體和細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)非常重要[9]。當(dāng)VDAC2表達(dá)減少，會(huì)使線(xiàn)粒體膜內(nèi)外代謝物質(zhì)交換減少，由此導(dǎo)致的ATP產(chǎn)生及利用障礙會(huì)影響線(xiàn)粒體發(fā)揮正常功能。

尚未有研究將AQP4與VDAC2對(duì)細(xì)胞水腫的調(diào)節(jié)作用聯(lián)系起來(lái)，或探討過(guò)二者間的相互作用機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)制備SD大鼠脊髓鈍挫傷(SCC)模型，采用免疫組織化學(xué)(IHC)技術(shù)、定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)，觀(guān)察脊髓損傷后VDAC2表達(dá)變化情況；蘇木精-伊紅(HE)染色、BBB 功能評(píng)分用于檢測(cè)脊髓損傷后組織和細(xì)胞的損傷程度以及大鼠運(yùn)動(dòng)功能的受損情況；運(yùn)用生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)AQP4和VDAC2的基因聯(lián)系；構(gòu)建慢病毒干擾AQP4大鼠模型，觀(guān)察AQP4干擾后SCC模型大鼠體內(nèi)VDAC2的表達(dá)變化；并通過(guò)以上步驟探討干擾AQP4對(duì)脊髓損傷過(guò)程中VDAC2表達(dá)的影響以及VDAC2的差異性表達(dá)在脊髓損傷修復(fù)過(guò)程中的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康成年SD大鼠114只，雌雄不限，體重200～240 g。由四川大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。將動(dòng)物分籠飼養(yǎng)，環(huán)境溫度控制在20～25 ℃。隨機(jī)把大鼠分為4大組，即假手術(shù)(Sham)組(n=11)、SCC組(n=69),取材時(shí)間點(diǎn)分為6、12 h和1、3、5、7、14、28 d；空載(Vector)組(n=17)、AQP4慢病毒干擾(AQP4-SH-LV)組(n=17)，取材時(shí)間點(diǎn)為手術(shù)后3、7、28 d。

1.2 AQP4慢病毒質(zhì)粒載體的制備

1.2.1 慢病毒質(zhì)粒的制備 將AQP4 siRNA序列(中國(guó)廣州，GeneCopoeia)克隆到紅色熒光蛋白(red fluorescent protein, RFP)標(biāo)記的載體中。再將該載體(5 μg)和慢病毒包裝質(zhì)粒 (1 μL, 中國(guó)廣州，GeneCopoeia)共轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞，生成慢病毒質(zhì)粒載體。48 h后取含有慢病毒質(zhì)粒的上清液，置于0.45 μmol/L的醋酸纖維素過(guò)濾器中過(guò)濾，除去濾液后取5 mL，3 500 r/min，離心半徑28.5 cm，離心25 min，除去上清液，將沉淀重新溶解在500 μL PBS溶液中。最后置于-80 ℃冰箱凍存。

1.2.2 載體注射 使用3.6%水合氯醛對(duì)大鼠進(jìn)行腹腔麻醉(30 mg/kg)，備皮后采用俯臥位固定，在T9～T11的位置沿背部正中段縱向依次切開(kāi)，分離皮膚、筋膜、肌肉；剝除T10的棘突及椎板，充分暴露該節(jié)段脊髓，使用腦立體定位儀(DW-5，成都泰盟)于T10節(jié)段脊髓擬打擊點(diǎn)左右兩側(cè)各注射慢病毒質(zhì)粒載體5 μL(AQP4-SH-LV組)或含有空載體的質(zhì)粒 5 μL(Vector組)。朝向大鼠尾側(cè)進(jìn)針，進(jìn)針角度與水平面呈45°，進(jìn)針深度3～5 μm。注射完畢后依次縫合肌肉、筋膜及皮膚，常規(guī)消毒及抗感染處理后，獨(dú)籠飼養(yǎng)。

1.3 動(dòng)物模型制備

慢病毒載體注射48 h后， AQP4-SH-LV組和Vector組大鼠使用3.6%水合氯醛腹腔注射麻醉(30 mg/kg)，常規(guī)消毒。俯臥位固定，依次拆下皮膚、筋膜、肌肉的縫合線(xiàn)；SCC組及Sham組大鼠使用同法麻醉，備皮，常規(guī)消毒，以 T10為中心，縱行切開(kāi)皮膚及皮下組織，分離椎旁肌肉，暴露棘突與椎板；Sham組大鼠僅咬除T10椎板后，縫合傷口，其余各組大鼠則采用改良Allen′s打擊法，在咬除T10椎板后，用Allen′s打擊儀從30 mm高處自由墜落，打擊對(duì)應(yīng)節(jié)段脊髓，大鼠出現(xiàn)脊髓充血和擺尾，代表?yè)p傷成功。打擊成功后，逐層縫合傷口，術(shù)后各組大鼠腹腔注射青霉素1 mL(1 600 000 U/mL)、5%葡萄糖氯化鈉溶液2 mL，小心護(hù)理，獨(dú)籠飼養(yǎng)。每天早晚擠壓大鼠膀胱協(xié)助排尿各1次，至大鼠恢復(fù)反射性排尿。護(hù)理時(shí)注意觀(guān)察皮膚有無(wú)壓瘡或感染、下肢有無(wú)潰爛。室溫維持 25～30 ℃，正常飲食。

1.4 大鼠行為學(xué)測(cè)試

采用BBB評(píng)分體系于術(shù)后1、3、5、7、14 d對(duì)各組大鼠進(jìn)行后肢運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分，包括0～21分，功能完全缺失為0分，完全正常為21分。評(píng)分由3位以上熟悉評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)的非本組實(shí)驗(yàn)人員進(jìn)行，最后選取3個(gè)人的有效評(píng)分取算數(shù)均值。

1.5 取材和切片制備

各組大鼠在術(shù)后根據(jù)需要在不同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行取材。深度麻醉大鼠，若用于qRT-PCR，則自左心室插管后剪開(kāi)右心耳，快速灌注0.9% NaCl，直接取1 cm損傷段脊髓，放入無(wú)RNA酶的EP管中-80 ℃保存。若用于形態(tài)學(xué)檢測(cè)，深度麻醉大鼠后，自左心室插管，剪開(kāi)右心耳，快速灌注PBS緩沖液，再灌注4%多聚甲醛。打開(kāi)椎弓管暴露脊髓段，切取損傷點(diǎn)前后1 cm的脊髓組織，放入4%多聚甲醛固定，48 h后取出固定好的脊髓組織進(jìn)行常規(guī)脫水、包埋以及切片(切片厚度為5 μm，每切5張選用1張)、攤片、貼片，37 ℃烘片后備用。

1.6 HE染色法

選用制備好的脊髓切片，65 ℃烤片2 h，染色流程：1)二甲苯(Ⅰ)10 min；2)二甲苯(Ⅱ)10 min；3)100% 水化乙醇(Ⅰ)5 min；4) 100% 水化乙醇(Ⅱ)5 min；5)95% 水化乙醇(Ⅰ)5 min；6) 95% 水化乙醇(Ⅱ)5 min；7)80% 水化乙醇5 min；8)RO水5 min；9)蘇木素液染色5 min；10)RO水漂洗5 min；11)0.5% 鹽酸乙醇分色8 s；12)自來(lái)水緩水流沖洗15 min返藍(lán)；13)伊紅液染色7 min；14)RO水漂洗2 min；15)80% 乙醇3 min；16)95% 乙醇(Ⅰ)1 min；17)95% 乙醇(Ⅱ)3 min；18)100% 無(wú)水乙醇3 min；19)二甲苯(Ⅰ)5 min；20)二甲苯(Ⅱ)5 min；21)中性樹(shù)膠封片。

1.7 免疫組織化學(xué)染色

選用制備好的脊髓切片，65 ℃烤片2 h。用免疫酶組化SP法進(jìn)行染色：與HE染色同法脫蠟、水化后，放入枸櫞酸鈉溶液中行高壓熱抗原修復(fù)，0.01 mol/L PBS漂洗，用3%H2O2，37 ℃，孵育15 min，封閉內(nèi)源性過(guò)氧化酶，PBS漂洗，使用5%正常山羊血清37 ℃孵育15 min封閉非特異性抗原，加一抗(1∶100)4 ℃放置18 h，取出切片，室溫下放置20 min，PBS漂洗，加入二抗工作液，37 ℃孵育15 min，PBS漂洗，加入辣根過(guò)氧化物酶，37 ℃孵育15 min，PBS漂洗，配制DAB-H2O2顯色液(1 mL過(guò)濾PBS+5滴0.3%H2O2+DAB粉末)，室溫下加DAB-H2O2顯色液反應(yīng)3～5 min，顯微鏡下充分顯色后，及時(shí)用RO水終止反應(yīng)，蘇木素復(fù)染5 min，RO水漂洗，1%鹽酸-酒精分色10 s，自來(lái)水返藍(lán)，梯度酒精逐步脫水，二甲苯透明，最后使用中性樹(shù)膠封片。光學(xué)顯微鏡400倍下觀(guān)察免疫陽(yáng)性反應(yīng)物分布情況并拍照。

1.8 熒光定量PCR

把1 cm脊髓損傷節(jié)段從-80 ℃保存的冰箱中取出，用Trizol(中國(guó)北京，TransGen Biotech)勻漿破碎脊髓組織細(xì)胞，經(jīng)氯仿、異丙醇、75%乙醇處理后得到總RNA。采用試劑盒 (中國(guó)南京，Vazyme biotech)將總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。設(shè)計(jì)大鼠內(nèi)參β激動(dòng)蛋白(β-actin)、VDAC2的上下游引物序列和探針序列。從冰箱中取出逆轉(zhuǎn)錄的cDNA，使用通用試劑盒(中國(guó)南京，Vazyme biotech公司)根據(jù)說(shuō)明進(jìn)行熒光定量PCR，獲得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。反應(yīng)條件：95 ℃ 2 min，95 ℃ 15 s，52 ℃ 20 s，60 ℃ 40 s，循環(huán)45次。以β-actin為內(nèi)參照，得到S形動(dòng)力學(xué)曲線(xiàn)后讀取Ct值，經(jīng)過(guò)人工校正后按2-ΔΔCt計(jì)算出相對(duì)表達(dá)量(表1)。

表1 引物序列信息

注：Tm為DNA解鏈溫度

1.9 生物信息學(xué)

采用GeneMANIA生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)AQP4和VDAC2兩基因之間的關(guān)系，網(wǎng)址：http://www.genemania.org。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 BBB評(píng)分

采用BBB評(píng)分檢測(cè)運(yùn)動(dòng)功能，評(píng)價(jià)大鼠脊髓損傷后的運(yùn)動(dòng)功能。Sham組大鼠各時(shí)間點(diǎn)評(píng)分均達(dá)到21分；對(duì)于SCC、AQP4-SH-LV、Vector組大鼠，脊髓損傷后1 d其后肢均癱瘓，BBB運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分結(jié)果為0，此后隨著后肢功能恢復(fù)，其評(píng)分逐漸增加，在第14天達(dá)到最大值。但在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)(1、3、5、7、14 d)，上述3組大鼠BBB評(píng)分均低于Sham組(P<0.05)； 此外，AQP4-SH-LV組大鼠評(píng)分結(jié)果在各時(shí)間點(diǎn)(1、3、5、7、14 d)均較Vector組高，其中，5、7 d兩組評(píng)分差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖1)。

圖1 BBB評(píng)分結(jié)果

注： 與Sham組比較，*P<0.05；AQP4-SH-LV組與Vector組比較，#P<0.05

2.2 脊髓鈍挫傷后VDAC2的表達(dá)變化

2.2.1 SCC后qRT-PCR結(jié)果 本實(shí)驗(yàn)采用qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)脊髓損傷后VDAC2的表達(dá)變化，結(jié)果表明，SCC組和Sham組大鼠在各時(shí)間點(diǎn)(6、12 h和1、3、5、7、14、28 d)均能檢測(cè)到VDAC2 mRNA轉(zhuǎn)錄。與Sham組相比，SCC組大鼠各時(shí)間點(diǎn)VDAC2的mRNA轉(zhuǎn)錄量均低于前者(P<0.05)。SCC組大鼠VDAC2 mRNA轉(zhuǎn)錄水平在脊髓損傷后隨時(shí)間的推移而發(fā)生改變，其在脊髓損傷后6 h明顯下降，并在第7天降至最低水平；第7天后其VDAC2 mRNA表達(dá)水平緩慢上升，至損傷后第28天，VDAC2的mRNA轉(zhuǎn)錄量高于第7天，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖2)。

圖2 qRT-PCR示VDAC2 mRNA的相對(duì)表達(dá)

注： SCC后VDAC2 mRNA的表達(dá)變化；與Sham組比較，*P<0.05；與SCC-7 d組比較，#P<0.05

2.2.2 SCC后IHC結(jié)果 采用免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測(cè)VDAC2蛋白表達(dá)的定位及半定量情況，結(jié)果顯示，VDAC2在各組大鼠脊髓灰質(zhì)神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、脊髓白質(zhì)的星形膠質(zhì)細(xì)胞中有表達(dá)，棕褐色免疫陽(yáng)性產(chǎn)物主要分布于細(xì)胞質(zhì)。SCC術(shù)后6 h和1、3、7、14 d，SCC組大鼠免疫陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)均低于Sham組(P<0.05)，且胞漿內(nèi)VDAC2陽(yáng)性反應(yīng)物明顯減少，提示VDAC2蛋白表達(dá)減少；其中，7 d陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)最少，14 d較7 d有所增加(P<0.05)，但依舊低于Sham組水平(圖3)。

圖3 Sham及SCC組大鼠脊髓組織VDAC2的IHC染色分布(400×)及免疫陽(yáng)性細(xì)胞統(tǒng)計(jì)

注： A～F:Sham組及SCC組大鼠脊髓組織VDAC2的IHC染色結(jié)果，比例尺=20 μm；黑色箭頭表示免疫反應(yīng)陽(yáng)性細(xì)胞； G：VDAC2免疫陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果；與Sham組相比較，*P<0.05；與SCC-7 d組比較，#P<0.05

2.3 HE染色

Sham組：Sham組大鼠脊髓結(jié)構(gòu)完整，灰白質(zhì)界限清楚；灰質(zhì)內(nèi)神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞胞體結(jié)構(gòu)完好，分布均勻；血管、中央管形態(tài)正常；白質(zhì)內(nèi)神經(jīng)纖維排列整齊而致密。SCC、Vector組：SCC造模后3 d，可見(jiàn)SCC組和Vector組大鼠脊髓組織廣泛出血，如脊髓中央管出血,毛細(xì)血管充血，血管周?chē)屑t細(xì)胞；灰質(zhì)中可見(jiàn)成片壞死區(qū),周?chē)M織水腫嚴(yán)重,細(xì)胞間隙和血管間隙明顯增大, 大量神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞腫脹、破裂，細(xì)胞核發(fā)生固縮，胞漿紅染加深；有神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞增生；脊髓灰質(zhì)和白質(zhì)界限模糊不清；損傷后7 d: 脊髓組織大部分液化壞死并有空洞形成，脊髓白質(zhì)破壞嚴(yán)重，形成大量囊腔和空泡，神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞腫脹有所減輕, 細(xì)胞間隙和血管間隙水腫逐漸減輕，充血消退, 仍有少量增生的膠質(zhì)細(xì)胞。AQP4-SH-LV組：大鼠SCC術(shù)后3、7 d，脊髓組織有出血現(xiàn)象，可發(fā)現(xiàn)與Vector組相比，該組大鼠脊髓內(nèi)血管周?chē)M織和神經(jīng)元的腫脹程度較輕，水腫體積減小，脊髓灰質(zhì)和白質(zhì)的界限較清晰；脊髓中央散在小部分壞死區(qū)，程度較輕，白質(zhì)內(nèi)大部分髓鞘完整且分布均勻(圖4)。

圖4 HE染色結(jié)果顯示各組大鼠脊髓組織情況(400×)

注： A～H:各組大鼠各時(shí)間點(diǎn)脊髓組織，比例尺=20 μm

2.4 慢病毒干擾AQP4后VDAC2的表達(dá)變化

2.4.1 慢病毒干擾AQP4后qRT-PCR結(jié)果 AQP4-RNAi-LV的模式圖如下，qRT-PCR結(jié)果顯示，慢病毒干擾后12 h，AQP4-SH-LV組大鼠AQP4的mRNA表達(dá)量與Vector組相比下降(P<0.05)，證明AQP4干擾模型制備成功；SCC術(shù)后7 d， AQP4-SH-LV組大鼠體內(nèi)VDAC2的mRNA表達(dá)量較Vector組大鼠上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖5)。

圖5 慢病毒干擾AQP4后VDAC2的表達(dá)變化

注：A：AQP4-RNAi-LV的模式圖，增強(qiáng)型RFP(mCherry FP)作為報(bào)告基因被插入到質(zhì)粒中，該框架也包括抗生素氨芐西林以及作為表達(dá)載體啟動(dòng)子的pUC Ori；B：AQP4-RNAi-LV感染后12 h AQP4 mRNA的表達(dá)變化；C：AQP4-RNAi-LV感染后7 d VDAC2 mRNA的表達(dá)變化；與Vector組比較，*P<0.05

2.4.2 慢病毒干擾AQP4后IHC結(jié)果 Vector組和AQP4-SH-LV組大鼠體內(nèi)VDAC2免疫陽(yáng)性產(chǎn)物分布于大鼠脊髓灰質(zhì)神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，脊髓白質(zhì)的星形膠質(zhì)細(xì)胞胞質(zhì)中。在SCC術(shù)后3、7、28 d，AQP4-SH-LV組大鼠VDAC2的免疫陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)相較于Vector組均有所增加，其中，3、7 d兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，28 d時(shí)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(圖6)。

圖6 AQP4-SH-LV及Vector組大鼠脊髓組織VDAC2的IHC染色分布(400×)及免疫陽(yáng)性細(xì)胞統(tǒng)計(jì)

注： A～F:AQP4-SH-LV及Vector組大鼠脊髓組織VDAC2的IHC染色結(jié)果，比例尺=20 μm；黑色箭頭表示免疫反應(yīng)陽(yáng)性細(xì)胞； G：VDAC2免疫陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果；與Vector組相比較，*P<0.05

2.5 生物信息學(xué)結(jié)果

利用GeneMANIA數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.genemania.org)，檢索時(shí)輸入AQP4與VDAC2基因并選擇物種大鼠(rattusnorvegicus)，預(yù)測(cè)AQP4與VDAC2基因在該物種中的聯(lián)系。結(jié)果顯示，兩基因在人類(lèi)和大鼠間均具有共表達(dá)(co-expression)、共定位(co-localization)、共享蛋白結(jié)構(gòu)域(shared protein domains)、物理結(jié)構(gòu)互作(physical interactions)、基因互作(genetic interactions)等聯(lián)系。通過(guò)蛋白質(zhì)相互作用預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示，VDAC2與AQP4蛋白質(zhì)均具有底物特異性通道活性、被動(dòng)跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性和通道活性等相關(guān)作用(圖7)。

圖7 GeneMANIA生物信息學(xué)方法檢測(cè)VDAC2與AQP4的關(guān)系

3 討論

脊髓損傷是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)的嚴(yán)重創(chuàng)傷，其導(dǎo)致的脊髓水腫在很大程度上影響脊髓損傷后的修復(fù)過(guò)程，而脊髓損傷后水腫的發(fā)生發(fā)展過(guò)程與線(xiàn)粒體能量代謝息息相關(guān)。AQP4和VDAC2作為調(diào)節(jié)水代謝和能量代謝的重要因子，對(duì)脊髓損傷的修復(fù)起著至關(guān)重要作用。

3.1 脊髓損傷后VDAC2表達(dá)的意義

VDAC2通過(guò)在線(xiàn)粒體外膜上形成親水性電壓門(mén)控通道，對(duì)線(xiàn)粒體外膜透化起門(mén)控作用，且因調(diào)控物質(zhì)出入的特性，在能量代謝、維持線(xiàn)粒體穩(wěn)態(tài)等方面也發(fā)揮著不可替代的作用[10]。本實(shí)驗(yàn)成功制備了SD大鼠SCC模型，在脊髓損傷后1 d，SCC組大鼠BBB評(píng)分降為0，3 d后隨著運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)，評(píng)分緩慢增加，但低于Sham組大鼠；脊髓灰質(zhì)周?chē)M織水腫嚴(yán)重且有大量神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞腫脹、破裂。與此同時(shí)，該組大鼠VDAC2的 mRNA表達(dá)明顯下調(diào)，VDAC2的免疫陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)減少，至28 d也未恢復(fù)到損傷前水平。上述結(jié)果提示，VDAC2的表達(dá)水平對(duì)維持正常的脊髓功能有重要作用，SCC后其表達(dá)下調(diào)不利于脊髓損傷恢復(fù)。研究[11]發(fā)現(xiàn)，VDAC2可能通過(guò)凋亡因子影響脊髓損傷后水腫的發(fā)生發(fā)展，Bax、 Bak等是Bcl-2 家族中的促凋亡蛋白。Bax可以透過(guò)線(xiàn)粒體外膜使得細(xì)胞凋亡，Bax受不斷轉(zhuǎn)運(yùn)到線(xiàn)粒體和逆向轉(zhuǎn)運(yùn)到胞漿的調(diào)節(jié)，在VDAC2缺乏的細(xì)胞中，Bax和Bak構(gòu)成的線(xiàn)粒體定位會(huì)受到影響，提示VDAC2在Bax和Bak進(jìn)入線(xiàn)粒體及維持線(xiàn)粒體外膜穩(wěn)定性中起重要作用。 Lauterwasser等[12]進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，線(xiàn)粒體外膜上的孔道蛋白VDAC2為Bax逆向轉(zhuǎn)運(yùn)平臺(tái)的基本成分，VDAC2具有授予線(xiàn)粒體外膜相關(guān)的Bax募集，以及通過(guò)逆向轉(zhuǎn)運(yùn)來(lái)抑制Bax的雙重作用。有研究[13]發(fā)現(xiàn)，VDAC2可作為促凋亡蛋白Bak激活的抑制劑。Lazarou等[14]通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在健康細(xì)胞中存在內(nèi)源性依賴(lài)VDAC2存在的非活性BAK。在線(xiàn)粒體外膜上，VDAC2與BAK的疏水尾部相互作用，將其隔離在一個(gè)非活性狀態(tài)，激活的Bak被VDAC2抑制。Pl?tz等[15]結(jié)果表明，當(dāng)Bcl-xs過(guò)表達(dá)，可干擾VDAC2-Bak的互動(dòng)，導(dǎo)致釋放Bak，而過(guò)表達(dá)VDAC2可大幅度降低Bcl-xs導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡。此外，Wu等[16]發(fā)現(xiàn)，VDAC1 和 VDAC2 基因敲除的小鼠，呼吸容量減少，因?yàn)榫€(xiàn)粒體外膜通透性降低，可導(dǎo)致氧化磷酸化所需的代謝物減少。另外，大量研究[17-19]結(jié)果顯示，VDAC與鈣離子進(jìn)出線(xiàn)粒體密切相關(guān)，提示VDAC 作為Ca2+進(jìn)出線(xiàn)粒體的通道，在維持鈣穩(wěn)態(tài)和細(xì)胞活性調(diào)節(jié)中起關(guān)鍵作用。VDAC2還具有胞漿酶的結(jié)合位點(diǎn)，包括己糖激酶(HK)和甘油激酶的同工酶，HK是細(xì)胞糖酵解過(guò)程重要的限速酶之一，VDAC2結(jié)合HK-1/HK-2后，可優(yōu)先利用線(xiàn)粒體產(chǎn)生ATP，使糖酵能供順利進(jìn)行[20]。因?yàn)閂DAC2控制著多種離子和代謝產(chǎn)物在線(xiàn)粒體內(nèi)外的轉(zhuǎn)運(yùn)，其表達(dá)水平可影響許多生理及病理過(guò)程。一些實(shí)驗(yàn)[21-23]已表明，VDAC2會(huì)影響ATP/ADP進(jìn)出線(xiàn)粒體，低表達(dá)時(shí)可抑制線(xiàn)粒體能量的產(chǎn)生和利用，與線(xiàn)粒體的能量代謝密切相關(guān)。而細(xì)胞線(xiàn)粒體能量代謝障礙時(shí)，會(huì)發(fā)生ATP生成減少，細(xì)胞膜鈉鉀泵功能障礙，細(xì)胞內(nèi)鈉離子和水的過(guò)多積聚，導(dǎo)致細(xì)胞水腫。無(wú)機(jī)磷酸鹽、乳酸和嘌呤核苷酸等代謝產(chǎn)物的蓄積，將增加滲透壓負(fù)荷，進(jìn)一步加重細(xì)胞水腫，這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)論相吻合。因此，本實(shí)驗(yàn)認(rèn)為脊髓損傷后VDAC2表達(dá)水平與水腫的發(fā)生發(fā)展直接相關(guān)，其表達(dá)下調(diào)不利于脊髓損傷恢復(fù)。

3.2 慢病毒干擾AQP4后可上調(diào)VDAC2的表達(dá)

AQP是一族構(gòu)成跨膜的水通道蛋白，主要功能是參與生物體內(nèi)細(xì)胞水分的調(diào)節(jié)，對(duì)維持組織內(nèi)水平衡具有重要作用。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中廣泛分布的是AQP4，其主要表達(dá)在腦和脊髓中的膠質(zhì)細(xì)胞膜或足突和室管膜細(xì)胞上，在神經(jīng)元中尚未發(fā)現(xiàn)其蛋白表達(dá)。在脊髓損傷后，AQP4表達(dá)增加，提示 AQP4高表達(dá)提供途徑，使得過(guò)量的水分進(jìn)入脊髓損傷區(qū), 從而引起脊髓水腫、脊髓壓力升高[24]。本項(xiàng)目的前期實(shí)驗(yàn)中，成功建立了AQP4的慢病毒干擾模型，行Allen′s法脊髓損傷后，qRT-PCR和IHC結(jié)果顯示，AQP4干擾后VDAC2表達(dá)水平上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，脊髓損傷后手術(shù)組大鼠體內(nèi)VDAC2的表達(dá)水平下降，與Sham組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；AQP4慢病毒干擾組大鼠體內(nèi)VDAC2的表達(dá)相對(duì)于Vector組大鼠明顯升高。生物信息學(xué)分析結(jié)果表明，AQP4與VDAC2具有共表達(dá)、共定位和共享蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域等關(guān)系。因此，本實(shí)驗(yàn)推測(cè)AQP4在脊髓損傷后的高表達(dá)可能對(duì)VDAC2表達(dá)有抑制作用，這不僅使得更多水分進(jìn)入細(xì)胞，線(xiàn)粒體腫脹，也使線(xiàn)粒體外膜上的VDAC2表達(dá)下降，結(jié)果導(dǎo)致線(xiàn)粒體能量的產(chǎn)生和利用受到抑制，進(jìn)一步增加了胞內(nèi)滲透壓負(fù)荷，加劇細(xì)胞水腫，對(duì)脊髓損傷后的修復(fù)過(guò)程起負(fù)面影響。

3.3 干擾AQP4促進(jìn)脊髓損傷的修復(fù)與上調(diào)VDAC2有關(guān)

AQP4廣泛表達(dá)于水分子流動(dòng)活躍的部位，其存在可能起著調(diào)節(jié)水代謝的作用，并參與多部位水腫的發(fā)生和發(fā)展。Hiroaki等[25]實(shí)驗(yàn)顯示，AQP4參與腦出血后期(3 d以后) 細(xì)胞毒性腦水腫的形成, 增加了細(xì)胞膜對(duì)分子的通透性, 導(dǎo)致胞內(nèi)水腫。在外傷性腦水腫大鼠腦中，受傷部位AQP 4的 mRNA 表達(dá)明顯高于腦部其他地方[26]。Yang 等[27]通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在腹膜注射去氨加壓素的水中毒模型中， 觀(guān)察到AQP4過(guò)表達(dá)的轉(zhuǎn)基因小鼠細(xì)胞毒性腦腫脹更為快速。此外，F(xiàn)u等[28]通過(guò)制備低氧處理大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞模擬低氧腦缺血的模型，也發(fā)現(xiàn)相比于AQP4 敲除型星形膠質(zhì)細(xì)胞，野生型星形膠質(zhì)細(xì)胞會(huì)更快速腫脹，并且細(xì)胞體積更大。另有一些實(shí)驗(yàn)研究[29]發(fā)現(xiàn)，AQP4的表達(dá)變化在脊髓損傷時(shí)脊髓水腫的形成和消退過(guò)程中起重要作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示，脊髓損傷后，AQP4-SH-LV組大鼠體內(nèi)VDAC2 mRNA的轉(zhuǎn)錄水平相較于Vector組大鼠有所上調(diào)，并伴隨有大鼠脊髓細(xì)胞水腫減輕，運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)較好的現(xiàn)象。

綜上所述，線(xiàn)粒體能量代謝功能障礙是導(dǎo)致細(xì)胞水腫加劇的關(guān)鍵性事件。脊髓損傷后，AQP4通過(guò)高表達(dá)導(dǎo)致細(xì)胞水腫，并下調(diào)VDAC2的表達(dá)水平，干擾了線(xiàn)粒體能量的產(chǎn)生和利用，進(jìn)一步增加胞內(nèi)的滲透壓負(fù)荷，加劇SCC后的脊髓水腫。人為干擾AQP4的表達(dá)，其對(duì)VDAC2的抑制作用減弱，VDAC2的表達(dá)得以上調(diào)，這使得線(xiàn)粒體能量代謝可維持在一定水平，從而減輕損傷后的脊髓水腫，有利于脊髓損傷的恢復(fù)。本研究從能量代謝的角度進(jìn)一步探討了損傷性脊髓水腫發(fā)生發(fā)展的分子生物學(xué)機(jī)制，為臨床上脊髓損傷的基因療法提供了新的治療靶點(diǎn)。