張 同，施承民，徐 玉，舒 若，曾玉劍，孫 亮，田 衍，肖博凱，李 慶，王昆華，羅華友

(昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院/云南省消化病研究所/云南省消化道疾病防治工程技術(shù)研究中心胃腸與疝外科，昆明 650032)

結(jié)直腸癌是世界范圍內(nèi)病死率較高的消化道惡性腫瘤之一。近年來，小分子非編碼RNA(microRNA,miR)在癌癥調(diào)控方面的研究報(bào)道逐漸增多。miR在血漿中穩(wěn)定存在，并在外周血差異性表達(dá)。miR-141-3p作為miR-200家族的一員，被報(bào)道參與了食管癌[1]、原發(fā)性肝細(xì)胞癌[2]、前列腺癌[3]、膠質(zhì)瘤[4]、瘢痕瘤[5]、胃癌[6]和結(jié)腸癌[7]等腫瘤形成過程。有研究報(bào)道m(xù)iR-141-3p在結(jié)直腸癌腫瘤組織中的表達(dá)下調(diào)[8-9]，也有研究報(bào)道m(xù)iR-141-3p在結(jié)直腸癌腫瘤組織中的表達(dá)上調(diào)[10]。磷酸酶與張力蛋白同源物(PTEN)[1,11]、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子Ⅱ型受體(TGF-β2)[12-13]和腫瘤抑制蛋白p53[4]分別被報(bào)道為miR-141-3p的靶基因。本研究比較分析miR-141-3p及其靶基因在結(jié)直腸癌患者血漿中的表達(dá)差異，以及手術(shù)前后的表達(dá)變化，旨在為結(jié)直腸癌的早期診斷和治療預(yù)后提供參考依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2011年12月至2014年12月本院接受手術(shù)治療的結(jié)直腸癌患者150例作為試驗(yàn)組，術(shù)前均未行放療或化療等治療，癌組織經(jīng)鏡檢確診為腺癌。同時(shí)選取150例健康志愿者作為對(duì)照組。試驗(yàn)組患者的平均年齡為(55.21±7.84)歲，其中男48例，女62例。對(duì)照組健康志愿者的平均年齡為(53.02±5.97)歲，其中男53例，女57例。所有對(duì)象均自愿簽署知情同意書。兩組年齡和性別比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P>0.05)，具有可比性。

1.2方法

1.2.1手術(shù)方法及術(shù)后隨訪 試驗(yàn)組結(jié)直腸癌患者均采用腹腔鏡和開腹結(jié)直腸癌根治術(shù)進(jìn)行治療[14-15]。術(shù)后3年平均每3個(gè)月隨訪1次，記錄患者腫瘤復(fù)發(fā)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和死亡等情況。

1.2.2血漿標(biāo)本采集 靜脈抽取結(jié)直腸癌患者手術(shù)前血液，手術(shù)后第7天血液[16]和健康志愿者血液各2 mL。血液標(biāo)本轉(zhuǎn)入乙二胺四乙酸(EDTA)采血管，室溫靜置待血液完全凝固后，離心分離血漿。收集血漿至新的離心管，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3血漿總RNA提取及反轉(zhuǎn)錄 各取400 μL上述血漿標(biāo)本，按miRNeasy Serum/Plasma kit試劑盒(Qiagen)的方法步驟抽提血漿中的總RNA，利用熒光分光光度計(jì)(Thermo Fisher)測(cè)定血漿RNA濃度。提取的RNA置于-80 ℃保存?zhèn)溆?。參照Taq-Man miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Applied BioSystems)的說明反轉(zhuǎn)錄cDNA。

1.2.4miR-141-3p及其靶基因檢測(cè) 參照GoTaq?qPCR Master Mix試劑盒(Promega)說明配置反應(yīng)液，在ABI 7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)儀(Applied BioSystems)上對(duì)上述合成的cDNA進(jìn)行RT-qPCR檢測(cè)。每個(gè)反應(yīng)重復(fù)3次。miR-141-3p及其靶基因的引物序列見表1。以U6小環(huán)RNA作為內(nèi)參[6,8]，結(jié)果采用2-△△Ct相對(duì)定量法[17]計(jì)算。分別按miR-141-3p、PTEN、TGF-β2和p53的相對(duì)表達(dá)水平將結(jié)直腸癌患者劃分為高值組和低值組，其中相對(duì)表達(dá)水平大于或等于平均值的患者歸為高值組，相對(duì)表達(dá)水平小于平均值的患者歸為低值組。

表1 用于RT-qPCR檢測(cè)用的引物序列

2 結(jié) 果

2.1血漿miR-141-3p及其靶基因在手術(shù)前后的表達(dá)水平變化 在實(shí)施手術(shù)前，試驗(yàn)組血液中miR-141-3p的表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組，靶基因p53的表達(dá)水平也顯著上升，而PTEN和TGF-β2的表達(dá)水平則顯著低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。手術(shù)后，試驗(yàn)組miR-141-3p和p53的表達(dá)水平顯著下調(diào)(P<0.05)，而PTEN和TGF-β2的表達(dá)水平顯著上調(diào)(P<0.05)，見圖1。

a：P<0.01，與對(duì)照組比較;b：P<0.05，與對(duì)照組比較

2.2血漿miR-141-3p及其靶基因的表達(dá)與結(jié)直腸癌臨床病理特征的關(guān)系 血漿中miR-141-3p、PTEN、TGF-β2和p53的表達(dá)水平與結(jié)直腸癌患者的性別、年齡和腫瘤發(fā)生部位等無顯著相關(guān)性(P>0.05)。miR-141-3p與腫瘤分化程度、浸潤深度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有顯著相關(guān)性(P<0.05)。PTEN和TGF-β2均與腫瘤分化程度、浸潤深度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)。p53與結(jié)直腸癌浸潤深度、腫瘤大小和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)，見表2。

表2 結(jié)直腸癌臨床病理特征與miR-141-3p、PTEN、TGF-β2和p53的相對(duì)表達(dá)水平

表3 miR-141-3p及其靶基因的表達(dá)與復(fù)發(fā)率和生存率的關(guān)系

2.3高值組和低值組結(jié)直腸癌患者復(fù)發(fā)率和生存率比較 miR-141-3p低值組患者的復(fù)發(fā)率低于高值組(P<0.05)，生存率也優(yōu)于高值組(P<0.05)。PTEN和TGF-β2高值組患者的復(fù)發(fā)率低于低值組(P<0.05)，生存率優(yōu)于低值組。p53低值組患者的復(fù)發(fā)率低于高值組(P<0.05)，生存率優(yōu)于高值組，見表3。

3 討 論

研究miR與靶基因之間的相互調(diào)控關(guān)系，可以了解結(jié)直腸癌的發(fā)生機(jī)制，為診斷和治療提供新的靶點(diǎn)[9,11]。目前，miR在結(jié)直腸癌研究方面已有較多的報(bào)道[18]，例如miR-21[19]、miR-106a[16]、miR-155[20]和miR-141-3p[8,10]等。但miR-141-3p在結(jié)直腸癌患者血漿中表達(dá)的報(bào)道較少，其靶基因及其與結(jié)直腸癌臨床病理和治療預(yù)后相關(guān)性的報(bào)道幾乎沒有。而在其他癌癥報(bào)道中，miR-141-3p可能與PTEN、TGF-β2和p53等存在直接的相互作用[1,4,12]。

本研究結(jié)果顯示，試驗(yàn)組結(jié)直腸癌患者手術(shù)前血漿中miR-141-3p的表達(dá)顯著高于對(duì)照組，p53的表達(dá)與之類似，而PTEN和TGF-β2的表達(dá)顯著低于對(duì)照組(P<0.01)。這與它們分別在胃癌和食管癌等癌癥中的表達(dá)情況一致[7,21-23]。試驗(yàn)組結(jié)直腸癌患者手術(shù)后，再次檢測(cè)其血漿中miR-141-3p、PTEN、TGF-β2和p53的表達(dá)水平，結(jié)果表明，術(shù)后miR-141-3p的表達(dá)水平比術(shù)前顯著降低(P<0.01)，p53的表達(dá)與之類似，術(shù)后PTEN和TGF-β2的表達(dá)水平比術(shù)前顯著升高(P<0.05)。這說明在結(jié)直腸癌患者血漿中，miR-141-3p與抑癌基因p53的表達(dá)規(guī)律基本一致，呈正相關(guān)，而與PTEN和TGF-β2的表達(dá)水平則呈負(fù)調(diào)控關(guān)系。這與之前在其他腫瘤組織中報(bào)道的結(jié)果基本一致[1,4,12]。這些結(jié)果說明miR-141-3p、PTEN、TGF-β2和p53可能參與了結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展過程。

本研究進(jìn)一步分析了miR-141-3p及其靶基因的表達(dá)水平與結(jié)直腸癌臨床病理特征的關(guān)系。結(jié)果顯示，miR-141-3p與多種臨床病理特征有顯著相關(guān)性，包括腫瘤分化、浸潤、分期和轉(zhuǎn)移等。PTEN和TGF-β2主要與腫瘤分化、浸潤和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)。而p53則與結(jié)直腸癌浸潤深度、腫瘤大小和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)。按相對(duì)表達(dá)水平分組分析后發(fā)現(xiàn)，miR-141-3p和p53低表達(dá)組的術(shù)后復(fù)發(fā)率低，生存率高；PTEN和TGF-β2高表達(dá)組的術(shù)后復(fù)發(fā)率低，生存率高。以上分析表明，結(jié)直腸癌患者血漿中miR-141-3p及其靶基因具有作為生物標(biāo)志物的潛力[18]，可能有助于結(jié)直腸癌的早期診斷、輔助治療和評(píng)估預(yù)后。