余 璨

(國家知識產(chǎn)權(quán)局專利局專利審查協(xié)作四川中心，四川 成都 610213)

1 引言

FMD是由FMDV引起偶蹄動物的一種急性、烈性傳染病，以直接接觸方式傳染，主要危害豬、牛、羊等家畜和其他家養(yǎng)、野生偶蹄動物，其傳染速度極快易引發(fā)大規(guī)模流行，對畜牧業(yè)的危害極大。引起FMD的FMDV是一種小核糖核酸病毒，其共有7種不同的血清型以及80種以上的亞型，各型間無交叉免疫，病后康復(fù)或免疫動物仍存在感染其它血清型病毒而發(fā)病的可能[1-4]。近年來，雖然北美洲、大洋洲和大部分歐洲等保持了無FMD疫情狀態(tài)，但是亞洲和非洲FMD流行仍然頻繁甚至疫情嚴重。隨著我國畜禽養(yǎng)殖規(guī)模及密度不斷擴大，F(xiàn)MD防治的重要性與迫切性愈加凸出。

疫苗免疫是防控FMD的主要手段，縱觀FMD疫苗的研發(fā)進程，其主要經(jīng)歷弱毒疫苗、滅活疫苗、新型疫苗等階段。近年來，隨著分子生物學的發(fā)展以及新免疫理論的提出，新型疫苗得到了發(fā)展并成為了疫苗研究的熱點和重點。在目前的新型疫苗中，以抗原表位為基礎(chǔ)制備的表位疫苗由于其針對性強、特異性高、廣譜性強，安全可靠等優(yōu)點而脫穎而出。近年來，F(xiàn)MD表位疫苗的專利技術(shù)取得了很大進步，同時專利信息是獲取該領(lǐng)域最新成果、產(chǎn)業(yè)現(xiàn)狀的重要來源。因此，本文從專利分析角度對FMD表位疫苗的技術(shù)研究進行總結(jié)，為安全有效的FMD疫苗的研制以及其他疾病的表位疫苗研究提供參考。

2 FMDV相關(guān)表位

早在1981年，Kupper等、Boothroyd等、Kleid等先后報道了具有免疫活性的FMDV VP1基因[5]。1982年，Pfaff鑒定到FMDV O型VP1中的第144-159位氨基酸序列為一個主要的抗體結(jié)合位點[6]，同年，Bittle等發(fā)現(xiàn)了處于FMDV O型Kaufbeuren毒株的VP1的第141-160、200-213位氨基酸序列的重要表位，并且進一步驗證了其能產(chǎn)生血清型特異型病毒中和抗體[7]。以此為開端，F(xiàn)MD表位疫苗研究的序幕正式拉開，研究者們從表位確定與篩選、表位構(gòu)建等方面對表位疫苗進行了探索和研究，極大豐富了FMD表位疫苗相關(guān)技術(shù)，F(xiàn)MD表位疫苗發(fā)展迅速。

2.1 表位類型

表位是指蛋白抗原可產(chǎn)生免疫性的最小區(qū)域[8]，具有刺激機體產(chǎn)生抗體或致敏淋巴細胞并能夠被其識別的部位，又稱抗原決定簇。通常情況下，免疫細胞僅識別抗原上的表位，因而抗體的特異性通常理解是針對表位而非完整的抗原分子而言的。表位通常是較短的氨基酸片段，并且根據(jù)與抗原受體結(jié)合的不同，可將表位分為B細胞抗原表位和 T細胞抗原表位；按表位結(jié)構(gòu)不同分為線型表位和構(gòu)象型抗原表位。線型表位見于T細胞表位和部分B細胞表位，而構(gòu)象型表位見于B細胞表位。FMDV由衣殼蛋和非結(jié)構(gòu)蛋白構(gòu)成，F(xiàn)MDV衣殼蛋白由四種結(jié)構(gòu)蛋白VP1、VP2、VP3和VP4組成，VP1-VP3位于衣殼蛋白的外側(cè)，組成衣殼蛋白亞單位，VP4位于病毒顆粒的內(nèi)部，衣殼蛋白VP1-VP4基因均參與抗原位點的形成。FMDV 的非結(jié)構(gòu)蛋白是除了衣殼蛋白和它們前體蛋白之外的所有由病毒編碼但不參與病毒衣殼組成的蛋白，包括成熟蛋白L、2A、2B、2C、3A、3B、3C、3D[9]。鑒于FMDV表位類型的缺乏會嚴重制約表位疫苗的發(fā)展，因此，本文整理了目前重要的結(jié)構(gòu)蛋白、非結(jié)構(gòu)蛋白的位點以及類型，如表1所示。

表1 結(jié)構(gòu)蛋白、非結(jié)構(gòu)蛋白重點表位類型表

2.2 表位篩選方式

雖然早在1982年，Bittle和Pfaff等就利用免疫原性多肽確定了位于FMDV結(jié)構(gòu)蛋白VP1中的表位，或者通過生化方法處理抗原分子以獲得多肽碎片，再利用單克隆抗體篩選能與之起陽性反應(yīng)的片段，并以此間接推測抗原表位分布區(qū)域及構(gòu)成表位的關(guān)鍵氨基酸[10-11]。但是，上述方法存在工作量大、效率低、成本高、難以獲得構(gòu)象表位的缺點。隨著噬菌體表面展示技術(shù)、計算機技術(shù)等的日臻成熟，抗原表位的篩選和鑒定方式取得了很大進步。

2.2.1 噬菌體表面展示技術(shù)

CN101597327A、 CN101948510A公開了采用噬菌體表面展示技術(shù)對FMDV的抗原表位進行篩選。噬菌體表面展示技術(shù)是利用表達的外源肽與噬菌體表面特定蛋白融合并展示于其表面，被展示的多肽可以保持相對獨立的空間結(jié)構(gòu)和生物特性，借以研究多肽的性質(zhì)、相互識別和作用，并據(jù)此從巨大的展示肽庫中選擇出具有特定功能的多肽[12]。噬菌體表面展示技術(shù)用于篩選表位肽具有簡便有效、成本低廉的優(yōu)點，以此設(shè)計的表位疫苗可能誘導(dǎo)更為有效的免疫應(yīng)答。

2.2.2 計算機軟件預(yù)測與篩選

隨著分子生物學、分子免疫學技術(shù)與計算機科學技術(shù)的交互滲透，以及核酸和蛋白質(zhì)序列及結(jié)構(gòu)信息的數(shù)量增加以及相應(yīng)數(shù)據(jù)庫的建立，借助于計算機預(yù)測抗原表位已成為目前表位篩選的重要方式。CN103897065A公開了采用DNA Star生物軟件對抗原表位進行預(yù)測。CN101838319A公開了多種表位預(yù)測工具，如用于B細胞表位預(yù)測的SYFPEITHI、 Bcepred、BepiPred、ABcpred等；用于Th表位預(yù)測的mhc2pred、MHCPred、Propred；用于CTL功能表位預(yù)測的BIMAS、SYFPEITHI、Predict、EPIPREDICY等。除了上述兩種重要的篩選方式外，合成重疊肽、質(zhì)譜分析、計算機預(yù)測與動物實驗篩選相結(jié)合也被應(yīng)用于FMDV表位的篩選和鑒定當中。

3 FMD表位疫苗

3.1 表位疫苗的構(gòu)建

3.1.1 抗原表位的連接模式

由于表位多肽的分子量小，既不足以引起機體的免疫又容易被細胞內(nèi)的蛋白酶所降解，因此為了克服上述抗原表位單獨存在時的缺陷，針對不同的使用目的、生產(chǎn)方式可以選擇不同的表位系統(tǒng)來增強抗原表位的免疫原性。

3.1.1.1 表位與載體連接

將表位多肽與較大蛋白載體等進行連接能夠得到均一的和結(jié)構(gòu)確定的免疫原。常用的載體涉及綠色熒光蛋白、乙肝病毒核心抗原、β-半乳糖苷酶等。CN1468958A將編碼FMDV A型與O型病毒的多表位的核酸序列串聯(lián)后與綠色熒光蛋白基因串聯(lián)，使之成為雙價多肽疫苗融合基因并通過表達獲得雙價多肽疫苗蛋白。乙肝核心蛋白基因是具有強免疫源性的蛋白基因，CN1090203A中用FMDV VP1的編碼141-160、200-213位氨基酸的基因與乙肝病毒核心抗原基因連接，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入細菌表達后得到融合蛋白。在采用β-半乳糖苷酶的研究中，復(fù)旦大學對其進行了深入拓展，CN1408349A中采用了β-半乳糖苷酶或是β-半乳糖苷酶第1位至第583位氨基酸肽段的同源序列作為載體蛋白與FMDV VP1蛋白中具有抗原性的肽段進行連接。CN1986562A將FMDV VP2蛋白第1-33位氨基酸的抗原表位連在載體蛋白半乳糖苷酶C端從而制備得融合蛋白LacZ-B1，該融合蛋白可作為新型FMD基因工程多肽疫苗免疫刺激佐劑，增強動物抗體應(yīng)答。CN101314036A中考慮到β-半乳糖苷酶全長基因太大會降低抗原表位基因在融合基因中的比例從而對免疫原性造成的影響，將pWR590中β-半乳糖苷酶的590個氨基酸截短310個氨基酸后，以pWR280作為新載體蛋白構(gòu)建得到抗FMDV基因工程多肽疫苗，比以pWR590為載體構(gòu)建的多肽疫苗具有更好的免疫效果。

3.1.1.2 抗體化抗原分子

由于將FMDV肽段與諸如β-半乳糖苷酶連接可能產(chǎn)生超敏反應(yīng)的副作用，因此“抗體化抗原分子”成為了抗原表位的構(gòu)建的新模式?？贵w化抗原分子是針對特異性B或T細胞表位產(chǎn)生免疫應(yīng)答的免疫原，其通常是將IgG重鏈恒定區(qū)的基因通過增加諸如FMDV表位肽這樣的小分子表位的分子量使其完全抗原化，并通過MHC分子與IgG分子Fc端的高效結(jié)合促進了靶標抗原的遞呈，在增強靶標抗原的免疫原性的同時還能延長靶標抗原的半衰期。CN1408349A、CN108330134A、CN108273054A 等專利申請中均公開了抗體化抗原分子。進一步的，CN101864434A基于激發(fā)被免疫動物的T淋巴細胞應(yīng)答，在現(xiàn)已有的抗體化抗原的分子的基礎(chǔ)上，產(chǎn)生了能誘導(dǎo)產(chǎn)生更高水平的中和抗體抗體化抗原與非結(jié)構(gòu)蛋白3D聯(lián)合使用的疫苗。同時，為實現(xiàn)"一針防多病" CN103897065A針對我國牛O型和Asia1型2個主要血清型的FMDV毒株的主要抗原表位序列，將優(yōu)勢抗原表位串聯(lián)后與牛IgG重鏈恒定區(qū)串聯(lián)得到復(fù)合多表位重組抗原，并將其與3D蛋白進行混合得到疫苗。此外，CN101721698A還對免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)、3D蛋白及其融合蛋白與3D蛋白聯(lián)合的方式進行了擴展。

3.1.1.3 與其他肽片段連接

將FMDV表位與其他的肽片段進行連接也是FMD表位疫苗的通常構(gòu)建方式，該種疫苗既能針對FMD又由于引入具有其他功能的肽片段，使得疫苗的功能靈活多樣。其他肽片段主要涉及到佐劑分子、T細胞表位等。CN101070348A基于FMDV的主要傳播途徑是呼吸道傳播，故粘膜免疫是其第一防線，基于粘膜免疫的原理，采用了良好的粘膜佐劑分子霍亂毒素B亞單位、大腸桿菌不耐熱毒素B亞單位與O型FMDV VP1的主要抗原表位連接并加入純化標簽His標簽最終獲得了免疫效果較好的疫苗。T細胞能增強了中和抗體的作用，T細胞表位的引入也是一種常見的疫苗構(gòu)建方式。T細胞表位通常涉及輔助性T細胞表位、外源T細胞表位以及通用T細胞表位。CN102406929A將輔助性T細胞表位引用于FMD疫苗的制備中。CN101579522A公開了FMDV VP1的B細胞表位與小反芻獸疫病毒上的一段能增強FMDV VP1上優(yōu)勢B細胞表位的強效外源T細胞表位進行連接構(gòu)建了含輔助性強效外源T細胞表位和FMDV主要抗原表位基因的多肽疫苗。在利用通用T細胞表位方面，CN105399802A中公開了含有通用T細胞表位、A型FMDV主要中和性抗原表位的FMD表位疫苗，隨后，CN105777909A為了將表位蛋白分子靶向于樹突狀細胞表面受體，提高表位蛋白的抗原遞呈效率，在CN105399802A的基礎(chǔ)上引入了趨化因子從而獲得了免疫效果增強的疫苗。

3.1.1.4 活載體表位疫苗

活載體疫苗是將外源基因插入到某些活載體基因內(nèi)，使其能夠高效表達又不影響疫苗株的正常生存與繁殖，同時，在這種疫苗中，抗原表位的構(gòu)象與致病性病原體抗原的構(gòu)象相同或非常相似。并且，在病毒類的活載體疫苗中，其還可以部分地模擬病毒攻擊的過程，可誘導(dǎo)產(chǎn)生體液免疫、細胞免疫甚至黏膜免疫。CN1827172A公開了以犬II型腺病毒為載體的重組豬Asia 1型FMDV VP1基因腺病毒載體活疫苗，獲得的重組病毒具有良好的遺傳穩(wěn)定性，并且可誘導(dǎo)豬產(chǎn)生特異的抗病毒中和抗體。CN102604898A選取兔出血癥病毒衣殼蛋白VP60作為展示外源FMDV B細胞表位的載體最終獲得了疫苗。

3.1.2 抗原表位的空間結(jié)構(gòu)構(gòu)建

由于具有游離巰基的半胱氨酸的存在可增加游離的多肽的免疫原性，當加上多個半胱氨酸殘基時也可得到類似的結(jié)果，以說明游離巰基半胱氨酸殘基的存在可以形成導(dǎo)致更適宜的二級結(jié)構(gòu)的肽二聚體，上述二級結(jié)構(gòu)可在體內(nèi)導(dǎo)致免疫復(fù)合物的形成。根據(jù)這一思路，通過在表位肽內(nèi)突變等引入半胱氨酸從而形成二硫鍵或是在肽段中引入二硫鍵是FMD表位疫苗從空間結(jié)構(gòu)上進行構(gòu)建疫苗的重要方式。CN103193869A將VP1結(jié)構(gòu)蛋白上B細胞表位中的134位氨基酸S換成半胱氨酸C，將156位氨基酸Q也換成半胱氨酸C，并采用固相多肽合成技術(shù)將設(shè)計好的氨基酸序列用多肽合成儀合成，合成過程中使兩個替換的半胱氨酸形成二硫鍵從而達到環(huán)肽的效果。通過氨基酸替換、二硫鍵形成可以模擬FMDV VP1結(jié)構(gòu)蛋白上的自然構(gòu)象，達到良好的免疫效果。

3.2 疫苗制備方式

基于前述不同的疫苗構(gòu)建方式，疫苗的制備方法通常分為生物合成和化學合成。生物合成方式主要涉及原核生物、真核生物、植物表達系統(tǒng)等類型。利用大腸桿菌的原核生物進行融合蛋白或疫苗的表達是疫苗制備領(lǐng)域中常見的蛋白表達的技術(shù)手段，CN101376887A、 CN109053898A公開了將涉及FMD表位的融合基因插入表達載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，獲得高效表達FMD重組免疫復(fù)合肽的基因工程菌。CN102580076A中應(yīng)用重組DNA技術(shù)，合成編碼豬O型FMDV表位的DNA序列，構(gòu)建了pGAPZαA-SP表達載體，并將該重組表達載體轉(zhuǎn)化宿主細胞畢赤酵母。CN1307000A、CN1429906A、CN1429907A、CN1820784A中公開了基于煙草花葉病毒、萵苣葉綠體、油菜葉綠體采用植物表達系統(tǒng)進行的FMD表位疫苗的生產(chǎn)。

在疫苗制備領(lǐng)域中，化學合成方法主要包括固相合成和液相合成兩種方方法。結(jié)合前述FMD表位疫苗構(gòu)建方式，向表位疫苗中引入半胱氨酸以形成二硫鍵的疫苗通常是采用化學方法進行合成。CN102180952A、CN102775478A、CN105418738A中公開了通過固相合成方式合成多肽，并將合成的抗原多肽與佐劑進行混合乳化后得到免疫效果好的疫苗。

4 結(jié)語

隨著FMD表位疫苗的不斷研發(fā)，F(xiàn)MD表位疫苗作為新型疫苗因其針對性強、特異性高、廣譜性強而脫穎而出。在研制FMD表位的疫苗中主要涉及到兩大方面，一是確定FMDV上的表位，二是完善FMD表位疫苗的構(gòu)建和合成方式。本文以專利數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)對FMD表位疫苗的研究進行分析，挖掘 FMDV相關(guān)的細胞表位以及表位疫苗的構(gòu)建與制備方式，為安全可靠的FMD疫苗的研制以及其他疾病的表位疫苗研究提供參考。