胡玉婷，李培源

(廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西 南寧 530001)

英國(guó)曼徹斯特大學(xué)Andre Germ等人的研究團(tuán)隊(duì)通過(guò)簡(jiǎn)易的機(jī)械剝離法初次獲得了具有二維晶體構(gòu)造的單層六元環(huán)石墨烯(graphene)。石墨烯具有獨(dú)特且優(yōu)異的光學(xué)、力學(xué)、電學(xué)性能[1]及特殊的含氧結(jié)構(gòu)，使其在能源材料、導(dǎo)體材料、電子設(shè)備等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用，但石墨烯也存在著親水性差等缺點(diǎn)，限制了其在某些領(lǐng)域上的發(fā)展。在眾多學(xué)者的不斷探索下，發(fā)現(xiàn)了石墨烯的衍生物氧化石墨烯(graphene oxide，GO)，氧化石墨烯具有親水性強(qiáng)、比表面積大、生物相容性好等優(yōu)異的特性，若對(duì)其進(jìn)行功能化地修飾，可以達(dá)到高效載藥的目的，使其在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域上有進(jìn)一步的發(fā)展。

1 氧化石墨烯的性質(zhì)

1.1 石墨烯的性質(zhì)

石墨烯中的碳原子雜化軌道為 sp2，是具有六元環(huán)狀的二維碳基納米材料[2]，厚度僅有0.335 nm，在二維材料中是最薄的，石墨烯可以通過(guò)機(jī)械剝離法、化學(xué)合成法、化學(xué)氣相沉淀法制備，這些方法各具優(yōu)劣，故在制備方法上，有待進(jìn)一步地改善。石墨烯具備穩(wěn)定的化學(xué)性質(zhì)及催化作用，獨(dú)特的二維結(jié)構(gòu)使其復(fù)合材料在催化、電池、傳感器等領(lǐng)域表現(xiàn)出優(yōu)良的性能，是極佳的電極修飾材料[3]。但其強(qiáng)疏水性限制了醫(yī)藥領(lǐng)域方面的應(yīng)用，需對(duì)其進(jìn)行改性或者一些化合物的接枝來(lái)進(jìn)一步擴(kuò)展應(yīng)用范圍。

1.2 氧化石墨烯的性質(zhì)

氧化石墨烯是石墨烯的含氧衍生物，故在某方面與石墨烯相似，比如碳原子結(jié)構(gòu)同為層狀平面二維，而差異則在于GO表面含有羥基、羧基、羰基等豐富的含氧基團(tuán)，故厚度大于石墨烯。氧化石墨烯具有兩親性，中間片層(環(huán)氧基、羥基)呈疏水性，邊緣(羧基、羰基)呈親水性，前者可通過(guò)π-π堆積或疏水作用負(fù)載一些疏水性物質(zhì)，后者可以為其功能化修飾提供位點(diǎn)，容易對(duì)其進(jìn)行表面修飾，為與其他基團(tuán)的結(jié)合提供了可能，令其進(jìn)一步作為載體在體內(nèi)更好地發(fā)揮作用提供了基礎(chǔ)。GO因含有較多含氧基團(tuán)故層與層之間通常帶負(fù)電荷，易與帶正電的基團(tuán)相結(jié)合，使片層間距增大。關(guān)于氧化石墨烯的制取方法目前有Brodie法[4]、Staudenmaier法[5]、Hummers法[6]三種較為大眾認(rèn)可。Brodie法制備效率低，且工序復(fù)雜、對(duì)環(huán)境污染較大,Staudenmaier法制備出的GO含氧量較前者提高但制備的效率依舊太低，而Hummers法是一種簡(jiǎn)單高效的制備方法，通過(guò)大量科研人員對(duì)Hummers法進(jìn)行改良，使此法成為當(dāng)今較為普遍的制備GO的方法。

2 氧化石墨烯的功能化修飾

氧化石墨烯表面具有豐富的含氧基團(tuán)，可通過(guò)疏水作用、氫鍵等作用吸附藥物和其他大分子[7]。這使得其在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用，GO在體內(nèi)的血液相容性和分散性可以通過(guò)改變其尺寸或性質(zhì)得到優(yōu)化，經(jīng)過(guò)修飾的GO可以擁有較低的毒性，良好的靶向性和緩釋性，易通過(guò)代謝排出，縮減對(duì)正常組織代謝的不良反應(yīng)，從而減少對(duì)有效物質(zhì)的浪費(fèi)。目前修飾方法大多分為共價(jià)修飾和非共價(jià)修飾兩種類型。

2.1 GO的共價(jià)修飾

GO的共價(jià)修飾多應(yīng)用其表面豐富的含氧基團(tuán)，與多種親水性較強(qiáng)的分子通過(guò)共價(jià)鍵接枝完成功能化修飾，目前多用殼聚糖(CS)、聚乙二醇(PEG)、聚乙烯亞胺(PEI)與GO表面的含氧官能團(tuán)進(jìn)行反應(yīng)，可以使GO的穩(wěn)定性及生物相容性得到進(jìn)一步提升。馬文石等[8]在溫和條件下將乙醇胺與GO進(jìn)行反應(yīng)，經(jīng)水合肼還原，經(jīng)反應(yīng)形成酯鍵和酰胺鍵從而獲得乙醇胺化的氧化石墨烯，干燥后再由超聲處理，產(chǎn)物能穩(wěn)定分散于水、乙醇等溶劑中，乙醇胺的加入使GO在介質(zhì)中的再分散性升高。孫彤等[9]制備羧基化的GO，用PEG- NH2對(duì)GO進(jìn)行修飾，通過(guò)化學(xué)物理表征，證實(shí)GO-CONH-PEG在水、機(jī)體環(huán)境中可以穩(wěn)定存在，且細(xì)胞毒性小。GO的共價(jià)修飾是通過(guò)化學(xué)反應(yīng)實(shí)現(xiàn)的，但化學(xué)反應(yīng)的程度難以得到控制，對(duì)GO的修飾及應(yīng)用產(chǎn)生了阻礙。對(duì)成功的案例分析可以發(fā)現(xiàn)試劑和官能團(tuán)活性的差異使發(fā)生化學(xué)反應(yīng)的程度不同，不同的官能團(tuán)應(yīng)選擇不同的試劑對(duì)其進(jìn)行修飾，GO表面的環(huán)氧基易于親核試劑發(fā)生取代反應(yīng)而開(kāi)環(huán)[10]。石墨烯邊緣的羧基反應(yīng)活性較高，故多以此基團(tuán)用于改性，除此之外，環(huán)氧基和羥基也可以用于修飾。Wang等[11]人將丙基胺接枝到GO表面，大大增加了GO的水溶性和穩(wěn)定性。Shan等[12]人在GO表面連接賴氨酸(PLL)，使GO擁有更多優(yōu)異的功能。

2.2 GO的非共價(jià)修飾

關(guān)于GO的非共價(jià)修飾，更多的是利用GO層間與分子化合物之間的非共價(jià)作用力，例如π-π堆積、氫鍵、范德華力等對(duì)化合物進(jìn)行物理吸附。此方法不僅保持了GO的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，還避免了對(duì)含氧基團(tuán)的改性，故在某些應(yīng)用方面非共價(jià)修飾更占優(yōu)勢(shì)。GO的非共價(jià)修飾法主要包括包裹聚合物、吸附生物大分子化合物等，比如蛋白質(zhì)、DNA等，均可以提高GO的穩(wěn)定性，減少細(xì)胞毒性，提高安全性[13]。崔欣等[14]利用疏水性質(zhì)以及π-π堆積在GO表面連接DNA適配體，構(gòu)建了GO的碳點(diǎn)標(biāo)記DNA適配體Hg+生物傳感器。雖然非共價(jià)修飾能為GO提供一些新的特性，但此修飾方法不夠穩(wěn)定，外界的改變對(duì)其影響頗大，故對(duì)此修飾方法的改性有待進(jìn)一步探索。

2.3 GO的其他修飾

磁性納米材料因擁有超順磁性、高矯頑力和比飽和磁強(qiáng)度高等優(yōu)良性質(zhì)，使其成為生物醫(yī)學(xué)范疇研究的焦點(diǎn)，其中磁性四氧化三鐵(Fe3O4)粒子的應(yīng)用較為廣泛。王俊梅[15]利用一步水熱合成法，制成了磁性Fe3O4通過(guò)表面改性后與GO結(jié)合獲得磁性微球/GO復(fù)合材料，通過(guò)對(duì)抗癌藥物5- FU的轉(zhuǎn)載，在不同 pH條件下釋放行為發(fā)現(xiàn)中空復(fù)合微球仍具有明顯的超順磁性。磁性GO還可以對(duì)中藥中難溶物質(zhì)進(jìn)行裝載后的高效利用，趙志娜[16]通過(guò)化學(xué)共沉淀法制備出磁性GO納米顆粒( Magnetic Graphene Oxide,MGO)，將其成功載入姜黃素(CUR)納米粒，制備CUR- MGO，對(duì)其進(jìn)行物化表征后發(fā)現(xiàn)復(fù)合納米粒載藥量達(dá)到4.61%，藥物導(dǎo)入成功，在體外釋放測(cè)試中表明其釋放功能受細(xì)胞環(huán)境pH影響，在酸性條件下釋放較快。沈俊海[17]等通過(guò)氧化超聲剝離法制備出GO后通過(guò)化學(xué)共沉淀與Fe3O4復(fù)合，獲得一組質(zhì)量比及組分不同的GO-Fe3O4復(fù)合物，通過(guò)表征及微觀構(gòu)象的觀察，并負(fù)載阿霉素(DOX)進(jìn)行正交試驗(yàn)，結(jié)果表明溫度及DOX濃度及溶液pH均影響藥物的釋放，且具有pH依賴性。

3 氧化石墨烯作為藥物載體的研究

現(xiàn)今已有包合物、納米乳、微球等多類型藥物載體都可增加藥物溶解度、延長(zhǎng)藥物的血液循環(huán)[18]，但由于載藥率低，難以對(duì)病灶部位進(jìn)行高濃度、高靶向性給藥，因此，研發(fā)新型載藥材料成為不可避免的新趨勢(shì)。GO作為一種新型的藥物載體，以其優(yōu)異的載藥性和負(fù)載率、病灶靶向給藥等方面受到諸多關(guān)注。氧化石墨烯的水溶性雖然比石墨烯高，但是其存在在鹽溶液及生理?xiàng)l件下容易聚集的情況，為了改善體內(nèi)的不穩(wěn)定性，學(xué)者們對(duì)其也進(jìn)行了多樣化的修飾。且如何在負(fù)載的藥物釋放后，清除GO載體在體內(nèi)產(chǎn)生的毒性，也是當(dāng)今必須重視的問(wèn)題。

3.1 GO載藥性能的研究

3.1.1 化學(xué)合成藥物的負(fù)載

當(dāng)今的諸多藥物均存在水溶性及靶向性較差等問(wèn)題，使藥物在體內(nèi)的吸收減弱或難以到達(dá)病灶部位，若利用GO的生物相容性及溶解性等特性對(duì)藥物進(jìn)行負(fù)載，可有效提高諸多藥物的藥效。楊琳等[19]通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)對(duì)比GO載入5- FU后的復(fù)合粒與5- FU本身殺滅致癌因子的能力，發(fā)現(xiàn)在藥物含量相同的條件下GO-5-FU殺滅乳腺癌4T1細(xì)胞的能力遠(yuǎn)高于5- FU本身，說(shuō)明GO具有對(duì)藥物的高負(fù)載率及靶向給藥功能。張龍姣等[20]先用葉酸對(duì)GO進(jìn)行修飾，而后負(fù)載多柔比星，置于pH值為5的磷酸緩沖液中，在溫度恒定在37℃條件下觀察藥物的體外釋放，定時(shí)定量取反應(yīng)時(shí)間間隔相同的反應(yīng)物進(jìn)行紫外分光光度法測(cè)定釋放量，結(jié)果顯示在釋放時(shí)長(zhǎng)為157 h時(shí)，藥物累計(jì)釋放量為44.85%，與釋放時(shí)間呈正相關(guān)且具有緩釋性。Liu Z等[21]研究聚乙二醇修飾GO即NGO- PEG(簡(jiǎn)稱NG-O)，作為納米載體，通過(guò)非共價(jià)鍵作用裝載難溶性抗癌藥物，NGO吸附SN38(喜樹(shù)堿)在機(jī)體環(huán)境下具有優(yōu)異的生物相容性和穩(wěn)定性，并且提高了SN38的水溶性，發(fā)現(xiàn)在體外實(shí)驗(yàn)中對(duì)癌細(xì)胞HCT-116具有更高殺滅力。

3.1.2 傳統(tǒng)中藥的負(fù)載

中藥里含有多種生物活性物質(zhì)，如黃酮類、多酚類物質(zhì)等，含有較好的抗菌及抗氧化等優(yōu)異的性能，但其水生物利用率低、在體內(nèi)不穩(wěn)定、水溶性差，若將其與GO制成復(fù)合納米材料，可以提高不溶于水的有效成分溶出，協(xié)助其藥物直達(dá)病處[22]，GO的抗菌性能在抗菌藥物領(lǐng)域具有寬闊的應(yīng)用市場(chǎng)，與中藥的清熱解毒、鎮(zhèn)痛消炎等療效類似[23]。仇云兵等[24]將金絲桃素通過(guò)π-π堆積和氫鍵作用接枝到GO上，所獲得的產(chǎn)物具有良好的穩(wěn)定性并可提高金絲桃素的光敏性和吸附量。徐志遠(yuǎn)等[25]采用PEG- GO對(duì)貝殼杉烷二帖類化合物毛萼乙素(eriocalyxin B)進(jìn)行負(fù)載，負(fù)載后的毛萼乙素親水性和在鹽溶液中的穩(wěn)定性得到改良。且負(fù)載率達(dá)18.8%，通過(guò)對(duì)癌細(xì)胞A549的毒性試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)PEG-GO-毛萼乙素對(duì)于細(xì)胞的殺滅能力遠(yuǎn)高毛萼乙素本身。李龍劍[26]通過(guò)構(gòu)建搭載蘆薈苷-GO水凝膠，對(duì)其體外抑菌性能測(cè)定、體內(nèi)皮膚刺激性及疤痕修復(fù)考察。結(jié)果表明蘆薈苷-GO凝膠具有一定的緩釋功能，且有良好的抑菌效果，對(duì)皮膚沒(méi)有刺激性，還能促進(jìn)皮膚血管新生，一定的復(fù)原創(chuàng)傷效果。

3.2 GO體內(nèi)安全性的研究

3.2.1 GO體內(nèi)毒性研究

隨著石墨烯及其衍生物在各大領(lǐng)域的應(yīng)用，機(jī)體對(duì)這類材料接觸的機(jī)會(huì)日漸增長(zhǎng)，因此，石墨烯材料的安全性不由得引發(fā)諸多熱議與關(guān)注。楊列程[27]利用PEG-GO負(fù)載陽(yáng)離子兩親性藥物(CADs)，發(fā)現(xiàn)作為藥物載體的GO會(huì)增加由藥物引發(fā)的磷脂質(zhì)病的概率。研究表明GO對(duì)細(xì)菌具有毒性作用，但細(xì)胞若長(zhǎng)期接觸石墨烯，細(xì)胞表面會(huì)出現(xiàn)石墨烯聚集，可導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[28]，使細(xì)胞的代謝率與石墨烯濃度呈負(fù)相關(guān)[29]。Zhang Y等[30]取系列質(zhì)量濃度差的GO通過(guò)尾部靜脈注射進(jìn)小鼠體內(nèi)，當(dāng)GO為小劑量時(shí)對(duì)小鼠無(wú)明顯毒性影響。當(dāng)GO劑量達(dá) 0.40 mg，小鼠產(chǎn)生慢性毒性反應(yīng)，其死亡率可達(dá) 44.4 %，肺部肉芽腫，GO沉積在各個(gè)器官，且無(wú)法從腎臟代謝排除。但另一研究發(fā)現(xiàn)GO在劑量為20mg/kg的情況下最初積累在肝、脾等臟器，后期又被機(jī)體代謝至微量毒性[31]。GO可以刺激線粒體制備活性氧(ROS)，激活炎癥及凋亡通路，造成重度肝功能不全，而聚集態(tài)和分散態(tài)的GO試驗(yàn)的小鼠沒(méi)有明顯的肺損傷[32]。石墨烯及其衍生物的毒性多與材料的直徑、劑量濃度、表面形態(tài)有關(guān)，我們可以通過(guò)連接具有特定分散功能的物質(zhì)來(lái)提高GO在體內(nèi)的分散性和體內(nèi)外安全性。例如可以使用聚乙二醇(PEG)對(duì)GO進(jìn)行功能化修飾，修飾后的GO具有更好地靶向性，在緩沖液或血液環(huán)境中有穩(wěn)定的分散性，可降低在機(jī)體組織的毒副作用，經(jīng)過(guò)PEG修飾的GO可以通過(guò)腎臟代謝以尿液形式迅速?gòu)捏w內(nèi)排出，從而不會(huì)引起組織器官的明顯毒性[3]。

因此對(duì)于GO的毒性而言，不同的給藥途徑、劑量、實(shí)驗(yàn)周期均會(huì)對(duì)毒性大小產(chǎn)生影響，而且作用機(jī)制尚未完全明確，因此我們不能對(duì)GO的毒性影響輕易下定論，需要更進(jìn)一步的探索。

3.2.2 GO尺寸對(duì)毒性的影響

血液相容性是對(duì)生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用的重要毒性評(píng)價(jià)，溶血可能導(dǎo)致器官衰竭甚至機(jī)體死亡。研究發(fā)現(xiàn)GO的血液相容性和體內(nèi)清除途徑與其尺寸大小有關(guān)[34-35]，尺寸為納米級(jí)別的GO會(huì)較易發(fā)生嚴(yán)重的溶血，而尺寸小至微米的GO不易引發(fā)溶血，但會(huì)易發(fā)凝血現(xiàn)象，為了降低溶血能力，需要在尺寸的修改上進(jìn)一步對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行改造。尺寸差異是GO作為載體在給藥系統(tǒng)體內(nèi)清除途徑的決定因素，通常小于10nm的GO能夠快速地通過(guò)腎臟途徑清除[36]，而微米尺寸的GO 則會(huì)通過(guò)肝臟轉(zhuǎn)移至膽道系統(tǒng)中代謝清除[37]。關(guān)于GO的安全性研究雖已有一些結(jié)論，但生理系統(tǒng)的多樣性使得我們不能輕而易舉對(duì)其毒性的高低及清除率輕易得出結(jié)論，需進(jìn)一步研究不同尺寸對(duì)給藥后清除率的影響及其作用機(jī)制。

4 結(jié)論與展望

氧化石墨烯作為藥物載體的應(yīng)用日益增多，如抗癌藥物的負(fù)載和靶向治療、生物成像和光動(dòng)力治療[38]，是一種優(yōu)點(diǎn)眾多的載體材料。對(duì)于目前GO的應(yīng)用存在著幾個(gè)問(wèn)題，第一是GO多以負(fù)載小分子藥物研究居多，對(duì)于負(fù)載如DNA、蛋白質(zhì)等生物大分子較少。故可以令GO與更多的大分子結(jié)合來(lái)提高負(fù)載物質(zhì)的多樣性。其二是對(duì)于GO的各類研究如靶向性與毒性多是在體外進(jìn)行，缺乏體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)，可以增加生物體建模的研究，對(duì)復(fù)合納米粒的四大體內(nèi)過(guò)程進(jìn)行探索，其三是石墨烯及其衍生物在機(jī)體內(nèi)長(zhǎng)期代謝沉淀的毒性物質(zhì)仍需進(jìn)一步研究，與藥物分子的相互轉(zhuǎn)化作用也仍需進(jìn)一步探索[39]。通過(guò)解決這些問(wèn)題可以實(shí)現(xiàn)GO的高效載藥及可控性，了解GO的作用機(jī)制及代謝途徑。總之，石墨烯及其衍生物在作為藥物載體這項(xiàng)研究中仍存在許多問(wèn)題，需要各界科研團(tuán)隊(duì)的加強(qiáng)學(xué)科融合，共同解決面臨的困難。