郭文久，凌君，周云

（1.安康學院秦巴中藥資源研究中心，安康學院化學化工學院，陜西安康725000；2.安康學院陜西省蠶桑重點實驗室，陜西安康725000）

天然蜂蜜經(jīng)蜜蜂采集花蜜之后，再經(jīng)過蜜蜂自己的口腔腸胃釀造而后存貯在蜂巢中，大多數(shù)情況下，蜂農(nóng)用搖蜜機或者榨蜜機從蜂巢中把蜂蜜分離出來，這種蜂蜜也叫分離蜜[1]。在蜜蜂采集花蜜、花粉、水活動中以及蜂農(nóng)在蜂群管理、搖蜜或者榨蜜、蜂蜜轉(zhuǎn)運、加工封裝等活動中會帶入一定的環(huán)境微生物，除了嗜滲酵母又叫嗜糖酵母之外，其他微生物基本都是因為蜂蜜含糖量高含水量低的高滲透性而被抑制而不能引起蜂蜜品質(zhì)的改變[2-3]。但是嗜滲酵母能在蜂蜜的高滲透壓的環(huán)境中持續(xù)繁殖，從而導致蜂蜜發(fā)酵產(chǎn)生二氧化碳氣體。隨著貯藏時間的延長、貯藏溫度的升高、蜂蜜含水量的上升，嗜滲酵母的發(fā)酵能力進一步增強，不但會產(chǎn)生大量的二氧化碳，也會使蜂蜜變酸，進而使蜂蜜產(chǎn)生變質(zhì)，從氣味上就能嗅到發(fā)酵之后的酸味。同時這些二氧化碳氣體在貯藏容器處于靜止狀態(tài)時能夠溶解于蜂蜜溶液中，但是在運輸途中，因為震動就會溢出到包裝瓶或者包裝桶的液面上，從而對容器產(chǎn)生額外的壓力，特別是在夏秋季高溫時節(jié)，剛收到的蜂蜜快遞馬上打開包裝瓶時就會產(chǎn)生爆裂現(xiàn)象，或者將長久靜置的蜂蜜拿到手上而并沒有大的震動都會產(chǎn)生溢出或者爆裂。這給蜂蜜的貯運安全性造成較大問題。同時蜂蜜因為發(fā)酵后變酸腐敗，最后到變質(zhì)不能食用而成為廢品[3]。

按照聯(lián)合國國際食品法典委員會（CAC）CODEX STAN 12-1981《蜂蜜標準》3.2的要求，蜂蜜是不能加熱的，所以就排除了通過巴氏等高溫殺菌的可能性。國外有采用伽馬射線消毒來解決[4]。而且在眾多的國內(nèi)外蜂蜜質(zhì)量標準中都一致認為，蜂蜜是不能通過加熱來殺菌的[5]。通過查閱文獻找到了應用于牛奶和果汁延長貨架期的超聲波技術(shù)來解決這個問題[4]。本研究使用的超聲波處理機已經(jīng)申請了發(fā)明專利，通過此專利的一個實例樣機處理蜂蜜，依照GB14963-2011《食品安全國家標準蜂蜜》測定了蜂蜜的酵母計數(shù)[6]，另外設(shè)計了模擬高溫貯運后的泡沫產(chǎn)生情況，從外觀上觀察超聲波技術(shù)對于蜂蜜中嗜滲酵母的殺菌或抑菌效果，用目視方法觀察了這些超聲波處理對蜂蜜結(jié)晶改變的情況。

1 材料方法

1.1 材料

蜂蜜：陜西省安康市漢濱區(qū)恒口鎮(zhèn)蜂元蜂產(chǎn)品加工坊，文字商標為蜂養(yǎng)元。蜂蜜為2017年8月由意大利蜂采集的百花蜜。但是由于要證明蜂蜜發(fā)酵終止情況，本次購買的是已經(jīng)有一定程度發(fā)酵，帶有少許酒味、打算冬季飼喂蜜蜂的蜂蜜，其為38°Bé。

1.2 主要儀器設(shè)備

超聲波處理機（專利申請?zhí)枮?01711343040.6和201721752538.3）：深圳市科美達超聲波設(shè)備有限公司；LX-C35型立式自動電熱壓力蒸汽滅菌器：合肥華泰醫(yī)療設(shè)備有限公司；SW-CJ-2FD型超凈工作臺：上海仙象儀器儀表有限公司；32G內(nèi)存iphone 7 plus手機：美國蘋果公司；210型顯微鏡：重慶奧特光學儀器有限公司；SPX-250B-G型恒溫箱：上海博訊實業(yè)實業(yè)有限公司。

1.3 藥品與試劑

氯硝胺18%甘油瓊脂、微生物培養(yǎng)基添加劑：青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司；丙三醇（分析純）：天津紅巖化學試劑廠試劑廠；葡萄糖（分析純）：天津化百世工有限公司。

1.4 超聲波處理蜂蜜后泡沫產(chǎn)生情況觀察

試驗使用已經(jīng)有一定程度發(fā)酵的、打算冬天飼喂蜜蜂的蜂蜜作為供試樣品。首先，分別取5次樣品，每次都取200 mL，設(shè)置超聲波功率600 W、頻率為20 kHz時進行處理。處理時間分別設(shè)為 0、1、3、5、7 min，待操作完成后用保鮮膜密封，重復3次上述操作。

將密封好的蜂蜜放入恒溫箱中，設(shè)置溫度為35℃，培養(yǎng)3 d。3 d過后將其取出來模擬快遞過程中的震動，對各個燒杯均勻搖動，要確保每一個燒杯搖動的力度和時間基本一致。然后按照氣泡數(shù)的多少分為0級到5級。沒有或者接近于無泡沫記為0級，泡沫極其少的記為1級，泡沫較少記為2級，泡沫常規(guī)記為3級，泡沫較多記為4級，泡沫超多記為5級。

1.5 超聲波處理后的蜂蜜結(jié)晶性質(zhì)觀察

將1.4觀察記錄完成后，將供試樣品放到秦嶺以南、巴山以北的漢水流域中游的冬季室溫（類似于長江流域中游的氣候特征）條件下3個月左右（2017年11月至2018年1月），然后連續(xù)觀察其結(jié)晶情況并記錄，如果出現(xiàn)有全部結(jié)晶之后就停止觀察并記錄結(jié)果，如果一直不能結(jié)晶最長觀察3個月終止，記錄最后結(jié)晶情況。記錄標記為0級-無結(jié)晶；1級-超低結(jié)晶；2級-極少數(shù)結(jié)晶；3級-較少結(jié)晶；4級-較多的結(jié)晶；5級-更多的結(jié)晶。

試驗地點統(tǒng)計了2017年11月～2018年1月歷史氣象資料結(jié)果為：高溫平均11℃，極端高溫23℃，低溫平均2.8℃，極端低溫-5℃，相對濕度平均75%。

1.6 嗜滲酵母計數(shù)

本試驗所用蜂蜜樣品與1.4一樣，蜂蜜已經(jīng)有一定程度發(fā)酵。每個處理用量筒量取樣品250 mL加到超聲波處理機中按照設(shè)定的條件即頻率20 kHz、功率600 W進行超聲波處理，處理完后倒入500 mL燒杯中用保鮮膜封口存入冰箱冷藏室備用。超聲波處理的時間設(shè)定為 0（對照）、3、6、9 min，重復 3 次。

按照GB14963-2011附錄A方法的步驟[6]進行酵母培養(yǎng)；按照GB 4789.2-2016《食品安全國家標準食品微生物學檢驗菌落綜述測定》觀察記錄并計算酵母計數(shù)[7]，單位為 CFU/g。

2 結(jié)果

2.1 超聲波處理后泡沫觀察

為了觀察經(jīng)過短時高溫貯運后蜂蜜產(chǎn)生二氧化碳的情況，采用1.4的試驗程序觀察泡沫產(chǎn)生的情況，經(jīng)過統(tǒng)計分析后得到圖1。

圖1 蜂蜜經(jīng)超聲波處理、在恒溫箱中經(jīng)35℃高溫培養(yǎng)3 d、搖動后產(chǎn)生泡沫的情況Fig.1 After honey was ultrasonic processed，cultured 3 d in the 35℃high temperature incubator，and shaken，the foam ranks were observed

從圖1看出，蜂蜜樣品經(jīng)過超聲波處理之后，對照即0 min的泡沫最多，隨著超聲波處理時間的延長，泡沫等級明顯減少，但是到5 min之后泡沫等級趨于穩(wěn)定，說明超聲波處理的作用僅僅在于消除酵母發(fā)酵釋放的二氧化碳所造成的那部分泡沫，而蜂蜜本身因為含糖及蛋白質(zhì)所引起的泡沫是不能被超聲波處理所消除的。與對照相比，處理5 min和7 min后，泡沫減少了90%以上。試驗數(shù)據(jù)經(jīng)過單因素完全隨機的方差分析之后，其處理間差異達到了極顯著。

為了展示圖1的超聲波消除泡沫的直觀情況，隨機選取了一個對照和一個7min處理兩個燒杯都是500 mL容積，所加蜂蜜均為200 mL，拍攝成照片，結(jié)果如圖2所示。

圖2 超聲波處理后蜂蜜產(chǎn)生泡沫差異的對比照片F(xiàn)ig.2 The foam comparative pictures after ultrasonic process

從圖2可以看出超聲波處理的效果是極其顯著的。由于蜂蜜樣品本身已經(jīng)有一定程度的發(fā)酵，所以在35℃條件下，恒溫培養(yǎng)3 d、再進行搖動后，對照產(chǎn)生的氣泡量特別大，而超聲波處理7 min，泡沫就明顯減少了，說明超聲波抑制酵母發(fā)酵特別明顯而且直觀。將圖2與圖1結(jié)合起來更容易理解超聲波處理的效果。

2.2 超聲波處理后結(jié)晶性質(zhì)的觀察

在CAC CODEX STAN 12-1981《蜂蜜標準》的3.1中明確表示化學或者生物化學處理不應當影響蜂蜜的結(jié)晶[5]。按照1.5方法觀察結(jié)晶性質(zhì)，平均溫度2.8℃。試驗處理3個月之后，沒有能觀察到結(jié)晶的差異，所以就未做結(jié)晶等級的統(tǒng)計記錄，結(jié)果僅僅進行了拍照，結(jié)果見圖3。

圖3 -2℃～15℃室溫存儲3個月后的結(jié)晶觀察結(jié)果Fig.3 The results of honey crystallization stored 3 months under room temperature between-2℃and 15℃

從圖3看出，沒有處理過的（最左邊一個燒杯）與 5 s、1、3、5、7 min 一樣都沒有結(jié)晶，目視觀察基本無差異。

使用本試驗所用的同樣的超聲波處理機進行了功率為600 W、頻率20 kHz、5 min處理時間的生產(chǎn)性試驗，所加工的2 t蜂蜜，采用500 g玻璃瓶進行封裝，按1.5進行貯存、觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，既有結(jié)晶的也有沒有結(jié)晶的?？芍a(chǎn)性試驗的蜂蜜原來會結(jié)晶的還是會結(jié)晶，原來不會結(jié)晶的還是不會結(jié)晶，說明超聲波處理不能改變蜂蜜結(jié)晶屬性。

2.3 超聲波處理后酵母計數(shù)結(jié)果

采用GB14963-2011附錄A方法[6]來測定超聲波處理后酵母計數(shù)情況，結(jié)果見圖4。

圖4 超聲波處理后的酵母計數(shù)結(jié)果Fig.4 The yeast count results after ultrasonic processes

從圖4看出，超聲波處理隨著處理時間的延長，蜂蜜中的嗜滲酵母得到了較大抑制，到3 min的時候只有原來的38%，6 min之后，酵母計數(shù)只有原來的14%，只有186 CFU/g。這個數(shù)字已經(jīng)達到了GB14963-2011[6]的酵母計數(shù)小于200 CFU/g的要求了。本試驗所用的蜂蜜樣品已經(jīng)有一定程度發(fā)酵，蜂蜜溶液里面已經(jīng)含有較大量的嗜滲酵母，如果采用新鮮的蜂蜜，里面的酵母含量很低，可能觀察不到抑菌效果。

比較圖1、圖2、圖4的結(jié)果，可以得到超聲波處理確實抑制了蜂蜜中的嗜滲酵母的生長或者活動，有效地控制了嗜滲酵母發(fā)酵產(chǎn)生二氧化碳氣體和腐敗變質(zhì)的可能性。

3 討論

本研究用35℃的發(fā)酵試驗和酵母計數(shù)的結(jié)果都明確證明了超聲波對嗜滲酵母的抑制作用。

超聲波本身是一種機械波，超聲波作用于被處理物品是受到了強大的機械沖擊力，因而物品內(nèi)部高級結(jié)構(gòu)可能會產(chǎn)生變化。蜂蜜中的微生物內(nèi)部具有嚴密的結(jié)構(gòu)性，受到超聲波沖擊力的影響后，其內(nèi)部分子的高級結(jié)構(gòu)可能會產(chǎn)生錯位、異位或者其他形式的高級機構(gòu)變化，從而致使微生物失去活性，或者活性降低。因為僅僅的超聲波處理，沒有進行加熱和添加額外物質(zhì)，所以不會引起蜂蜜品質(zhì)的改變。這應該是最經(jīng)濟和環(huán)保的品質(zhì)保護措施。

采用超聲波技術(shù)經(jīng)過短時間處理即可抑制嗜滲酵母的活動，其工藝并不是特別復雜，除此之外，超聲波處理的安全性也是毋容置疑的。

蜂蜜結(jié)晶雖然涉及了葡萄糖、果糖、松三糖、蔗糖、糊精和膠體物質(zhì)等眾多物質(zhì)，但最主要的還是葡萄糖和果糖的比例[8]。按照CAC CODEX STAN 12-1981蜂蜜標準的3.3的要求[5]，不應當采用化學或者生物化學處理來影響蜂蜜的結(jié)晶性質(zhì)，而本試驗研究觀察到，用于抑菌的短時（小于10 min）超聲波處理沒有能影響蜂蜜的結(jié)晶。作者嘗試1 h以上的長時間超聲波處理是能夠改變蜂蜜結(jié)晶的（資料未展示），但是長時間的處理也會使蜂蜜液體溫度明顯升高，但是即使是超過2 h以上的超聲波處理，蜂蜜液體的溫度也不可能超過50℃，這個溫度界限是快速產(chǎn)生羥甲基糠醛的臨界溫度。

生產(chǎn)試驗用的是百花蜜，其花蜜來源眾多且不穩(wěn)定，造成了葡萄糖和果糖的比例不一致，所以才會出現(xiàn)有包裝瓶中的蜂蜜會結(jié)晶有的不會結(jié)晶。而且就結(jié)晶的蜂蜜而言，有結(jié)晶多的，也有結(jié)晶少的。從生產(chǎn)性試驗上進一步說明了，這種短時間的超聲波處理不能改變蜂蜜的結(jié)晶性質(zhì)。而加熱等處理方式可以破壞形成結(jié)晶的晶核，導致最后不會結(jié)晶。但是都知道加熱之后會導致蜂蜜的酸度、羥甲基糠醛和淀粉酶活性新鮮度三指標明顯改變，這是如CAC CODEX STAN 12-1981等國際通性標準所不允許的。

4 結(jié)論

本研究采用超聲波技術(shù)在小于10 min的時間內(nèi)達到抑制蜂蜜嗜滲酵母的活動，從而阻止蜂蜜發(fā)酵產(chǎn)生二氧化碳帶來的運輸安全問題和蜂蜜腐敗風險。

從發(fā)酵發(fā)泡試驗得到5 min之后泡沫的生成量趨于穩(wěn)定，而酵母計數(shù)試驗也得到了類似的結(jié)果。這不但說明了結(jié)果的穩(wěn)定可靠性，也說明了最佳的超聲波處理時間定在5 min到6 min就可以達到抑菌的目的。

本研究僅僅論及了超聲波處理蜂蜜后嗜滲酵母的問題，還有大量的問題需要進一步研究，在后續(xù)論文中，將進一步揭示蜂蜜經(jīng)超聲波處理后硒含量、蛋白質(zhì)含量等改變，以及超聲波處理蜂蜜后如酸度、羥甲基糠醛和淀粉酶活性等新鮮度品質(zhì)的改變。從而進一步論證超聲波處理給蜂蜜的安全性和內(nèi)在品質(zhì)帶來的影響。