梁 群 王 叢 朱永志△

（1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江哈爾濱 150040）

腦出血屬于中醫(yī)出血性中風(fēng)范疇［1］。如何降低腦血管疾病的死亡率和致殘率一直是醫(yī)學(xué)界要攻克的重點(diǎn)。隨著醫(yī)學(xué)界的專家們對(duì)急性腦血管疾病的不斷探索，應(yīng)用中醫(yī)中藥治療急性腦出血逐漸受到國(guó)內(nèi)外專家的重視，臨床研究也顯示療效顯著［2-4］。中風(fēng)1號(hào)為本文通信作者朱永志教授總結(jié)四十余年治療急性期腦出血經(jīng)驗(yàn)形成的方劑，主要功效為活血化瘀。腦出血多為瘀阻腦竅，瘀血在急性期不除反而阻礙腦組織血運(yùn)循環(huán)使致殘率增加。前期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)中風(fēng)1號(hào)可以減輕腦水腫、保護(hù)神經(jīng)組織［5］，為中醫(yī)內(nèi)科保守治療急性腦出血奠定了基礎(chǔ)。本次實(shí)驗(yàn)研究將在前期研究的基礎(chǔ)上進(jìn)一步明確中風(fēng)1號(hào)治療急性期腦出血的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)別SD雄性大鼠40只，許可證號(hào) SCXK（京）2016-0006，體質(zhì)量 180～220 g，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心代為購(gòu)買。普通專用飼料喂養(yǎng)于溫度（22±4）℃，相對(duì)濕度40%～70%，自然光線的實(shí)驗(yàn)室，經(jīng)過1周的適應(yīng)性飼養(yǎng)后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格遵守動(dòng)物福利與倫理原則，在黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理和使用委員會(huì)監(jiān)督下進(jìn)行，倫理號(hào)2017092001。

1.2 試藥及儀器 1）試劑：兔抗大鼠Bcl-2、Bax多克隆抗體購(gòu)自Abcam公司；即用型快速免疫組化Max VisionTM試劑盒及 DAB顯色試劑購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。2）藥物：中風(fēng)1號(hào)（組成：水蛭10 g，生大黃10 g，澤瀉15 g，三七粉10 g，生地黃15 g。由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院制劑室熬制），按動(dòng)物體表面積比率換算大鼠灌胃量，常規(guī)水煎至3.5 g/mL（每毫升含生藥3.5 g）。阿莫西林鈉舒巴坦鈉（哈藥集團(tuán)生產(chǎn)，批號(hào)17070703-2），甘露醇（石家莊四藥有限公司生產(chǎn)，批號(hào)1709130503）。3）儀器：大小鼠腦定位儀（上海玉研科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn)）、腦立體定位進(jìn)樣針（上海玉研科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn)）、動(dòng)物顱骨鉆（上海玉研科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn)）、切片機(jī) （德國(guó)萊卡生產(chǎn)）、超凈工作臺(tái)（蘇凈安泰生產(chǎn)）、光學(xué)顯微鏡（日本奧林巴斯公司生產(chǎn)）。

1.3 分組及造模 SD大鼠40只隨機(jī)分為4組，每組10只，分別為假手術(shù)組、模型組、中風(fēng)1號(hào)組、甘露醇組。除假手術(shù)組外，其余大鼠參照文獻(xiàn)［6］的方法制備模型。用10%水合氯醛按大鼠體質(zhì)量計(jì)算麻醉藥用量進(jìn)行腹腔注射麻醉。大鼠俯臥位固定于立體定位儀上，充分暴露囟門消毒備皮后切開大鼠頭頂部正中線皮膚約1 cm，暴露骨膜及前囟點(diǎn)，在前囟點(diǎn)右側(cè)3.5 mm，后0.2 mm處用牙科鉆鉆出直徑約1.0 mm的圓孔，深達(dá)硬腦膜表面。同時(shí)鼠尾用酒精消毒，距尾末端3 cm處剪斷用微量注射器抽取50 μL血液，把微量注射器固定在立體定位儀上，針頭沿鉆孔進(jìn)針約6 mm，以20 μL/min速度將50 μL血液緩慢推進(jìn)腦組織，留針觀察約5 min后緩慢出針。在留針期間包扎大鼠尾部傷口。取適量牙科水泥用純凈水調(diào)成糊狀封閉顱骨創(chuàng)口，待牙科水泥略干后縫合頭皮并用碘酚局部消毒，可在傷口表面撒適量抗生素以防止感染影響指標(biāo)變化。假手術(shù)組：動(dòng)物接受與模型組相同的操作但腦組織不注血。

1.4 給藥方法 在造模后2 h大鼠完全蘇醒后開始計(jì)時(shí)，中風(fēng)1號(hào)組每日2 mL中藥湯劑（劑量約為成人用量的1倍）灌胃，假手術(shù)組、模型組每日等量生理鹽水灌胃，甘露醇組給予大鼠尾靜脈注射甘露醇0.5 g/（kg·d），共給藥 3 d。

1.5 標(biāo)本采集與檢測(cè) 給藥3 d后，大鼠吸入麻醉后頸椎離斷處死，開顱取腦，以針道為中心，前后各移動(dòng)2 mm切取4 mm厚腦組織。將切片浸于二甲苯中脫蠟0.5～1 h，乙醇脫水（步驟為 100%乙醇 5 min、100%乙醇5 min、95%乙醇5 min、80%乙醇5 min），蒸餾水沖洗。在室溫下切片，用3%甲醇雙氧水封閉20～30 min，自來水沖洗；采用高壓修復(fù)之后放入PBS中。然后用免疫組化筆將組織圈住，切片上滴加山羊血清封閉液，保持在室溫20～30 min。甩去多余液體，不洗，再在切片上滴加目的一抗，4℃過夜，次日取出來后待切片恢復(fù)至室溫后，放入PBS洗3次，每次5 min。切片上滴加二抗，37℃避光20 min后，放入PBS中洗3次，每次5 min，然后滴加DAB染液顯色5～10 s，水洗終止顯色。最后采用蘇木素復(fù)染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，封片完成。選擇各組的陽性和陰性組織相進(jìn)行顯微照相；選擇各組有意義的組織相進(jìn)行讀取分析，最后存盤。顯微鏡下Bcl-2和Bax陽性反應(yīng)物在胞漿或胞核有棕色顆粒者為陽性細(xì)胞，計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（±s）表示，符合正態(tài)分布的采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，不符合的用秩和檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

見表1，圖1，圖2。假手術(shù)組3 d后僅有少量Bcl-2、Bax陽性細(xì)胞，與假手術(shù)組比較其余各組血腫周圍腦組織Bcl-2、Bax陽性細(xì)胞數(shù)均明顯增多。模型組Bc1-2蛋白、Bax蛋白與中風(fēng)1號(hào)組、甘露醇組比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。中風(fēng)1號(hào)組與甘露醇組Bcl-2/Bax比值遠(yuǎn)大于1，中風(fēng)1號(hào)組與甘露醇組比較治療效果更顯著（P＜0.05）。

表1 各組 Bcl-2及 Bax陽性細(xì)胞數(shù)比較（個(gè)，±s）

表1 各組 Bcl-2及 Bax陽性細(xì)胞數(shù)比較（個(gè)，±s）

與模型組比較，*P＜0.05；與甘露醇組比較，△P＜0.05

組 別 n Bcl-2/Bax Bcl-2 Bax假手術(shù)組 10 1.03±0.03模型組 10 0.79±0.06甘露醇組 10 1.30±0.74*1.75±0.64 1.70±0.82 23.00±3.38 29.50±4.38 30.80±4.16* 23.40±2.91*中風(fēng) 1號(hào)組 10 1.75±0.26*△35.60±2.37*△ 20.70±1.70*△

圖1 各組大鼠腦組織Bax蛋白的表達(dá)（免疫組織化學(xué)法，400倍）

3 討 論

圖2 各組大鼠腦組織Bcl-2蛋白的表達(dá)（免疫組織化學(xué)法，400倍）

腦出血一直是臨床上的常見病，因其發(fā)病率和致殘率均很高，造成的家庭負(fù)擔(dān)較重，故受到醫(yī)學(xué)界的廣泛重視。經(jīng)多年研究，中醫(yī)藥治療腦出血逐漸得到醫(yī)學(xué)界的認(rèn)可。中醫(yī)理論中認(rèn)為出血性中風(fēng)為血不循經(jīng)、血溢脈外引起的離經(jīng)之血積蓄于腦［7-8］，血不循經(jīng)可因氣虛不固攝血液、肝陽上亢等多種因素引起，以往一致認(rèn)為急性期腦出血應(yīng)用活血化瘀藥物會(huì)加重出血或引起再出血，所以以前活血化瘀一直是急性期腦出血的治療禁區(qū)［9］。但隨著醫(yī)學(xué)界對(duì)腦出血的不斷研究與探索發(fā)現(xiàn)：但凡血液不能滋養(yǎng)周身，溢出脈外，即使是鮮血亦都?xì)w屬于瘀血范疇，即“離經(jīng)之血即為瘀”［10-12］。

朱永志教授根據(jù)多年臨床經(jīng)驗(yàn)認(rèn)為腦出血的形成即為瘀血阻滯于腦絡(luò)，離開經(jīng)脈循行的血液就已經(jīng)成為瘀血。瘀血貫穿于出血性中風(fēng)的始終［13］。所以在腦出血急性期辨證用藥時(shí)活血化瘀為針對(duì)其病因病機(jī)用藥，加之合理的君臣佐使相配伍能共同達(dá)到救治目的。朱永志教授一直從事中醫(yī)神經(jīng)內(nèi)科疾病的研究工作，在應(yīng)用中醫(yī)中藥治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病尤其是出血性中風(fēng)的研究及診治方面積累了豐富的臨床資料和寶貴經(jīng)驗(yàn)。中風(fēng)1號(hào)是朱永志教授依據(jù)多年臨床經(jīng)驗(yàn)總結(jié)出的中藥湯劑，其由水蛭、生大黃、澤瀉、三七粉、生地黃組成。其中水蛭功擅破血、逐瘀消癓。大黃取其活血祛瘀之效用于血熱妄行致血不歸經(jīng)出現(xiàn)的腦出血。澤瀉可利水滲濕泄熱，減輕腦水腫降低顱內(nèi)壓。三七粉化瘀止血使瘀血不留于絡(luò)。生地黃清熱養(yǎng)血，養(yǎng)陰生津。水蛭為君，生大黃為臣，其余為佐使藥，諸藥共奏活血祛瘀之功效。

本實(shí)驗(yàn)在大量臨床觀察基礎(chǔ)上驗(yàn)證中風(fēng)1號(hào)治療急性期腦出血的作用機(jī)制。當(dāng)急性腦出血發(fā)生時(shí)腦組織處于缺血缺氧狀態(tài)，Bc1-2和Bax會(huì)保護(hù)性增高［14］。但Bax的高表達(dá)會(huì)抑制Bc1-2的表達(dá)而加重腦組織損傷［15］。本實(shí)驗(yàn)研究通過自體尾靜脈注血制作大鼠急性腦出血模型，通過3 d的給藥發(fā)現(xiàn)，中風(fēng)1號(hào)可使腦組織缺血缺氧改善，Bc1-2表達(dá)增加而Bax表達(dá)減少，Bc1-2/Bax值增加。證實(shí)中風(fēng)1號(hào)可通過調(diào)控腦出血大鼠細(xì)胞凋亡基因減輕腦出血后的神經(jīng)損傷，為臨床上中風(fēng)1號(hào)治療急性期腦出血提供依據(jù)，再次證實(shí)中藥可以治療急危重癥。