孫 蓮， 駢繼鑫， 李 娟

(新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院， 烏魯木齊 830011)

桑樹(MorusalbaL.)為多年生落葉性木本植物，喬木多，灌木少，其皮、葉、枝和果實都具有藥用作用，桑葉(Foliummori)和桑枝(Ramulusmori)中含有多種活性成分，主要有黃酮類、生物堿類、揮發(fā)油、香豆素類、甾體類、三萜類和多糖類等[1]，具有清除氧自由基、降血糖、降血脂、抗粥樣硬化和抗炎等藥理作用[2-7]。微乳薄層色譜是以微乳液為流動相進行的薄層分析。微乳液是由表面活性劑、助表面活性劑、油和水按一定的比例混合而成的無色透明、低粘度的熱力學(xué)穩(wěn)定體系，與傳統(tǒng)的薄層色譜法相比，具有靈敏度高、重現(xiàn)性及分離效率好、斑點圓而集中等優(yōu)點[8-15]。本研究采用微乳液薄層分析法對桑葉和桑枝中的活性成分進行定性鑒別，為桑葉和桑枝的質(zhì)量控制提供依據(jù)，現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1儀器CAMAG LINOMA T5型半自動點樣儀(瑞士卡瑪公司)，CAMAG REPROSTAR 3型薄層色譜數(shù)碼成像系統(tǒng)(瑞士卡瑪公司)。

1.2試藥綠原酸對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號110753-200413)，蘆丁(中國藥品生物制品檢定所，批號100080-200707)，東莨菪內(nèi)酯對照品(北京寶賽希望生物科技有限公司，批號D-020-140728)，桑皮苷A(上海圻明生物有限公司，批號161112)，桑辛素對照品(上海圻明生物有限公司，批號161109)，純度均>98%；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3藥材桑葉和桑枝2017年5月采自新疆10個不同產(chǎn)地(1庫車縣、2烏魯木齊市、3吐魯番市、4庫爾勒市、5哈密市、6阿拉爾市、7疏勒縣、8和田市、9北屯市、10呼圖壁縣)，經(jīng)新疆醫(yī)科大學(xué)生藥教研室帕麗達·阿不力孜教授鑒定為多年生落葉性木本植物桑(MorusalbaL.)的葉和枝。

2 方法與結(jié)果

2.1溶液的制備

2.1.1 供試品溶液的制備 稱取桑葉、桑枝的干燥粉末各5.0 g，分別置于250 mL的錐形瓶中，加入85%乙醇100 mL，超聲提取2次，每次30 min，合并提取液， 4 000 r/min離心5 min，將提取液濃縮至5 mL，備用。

2.1.2 對照品溶液的制備 稱取桑皮苷A、綠原酸、蘆丁、東莨菪內(nèi)酯、桑辛素對照品各2.5 mg，置于10 mL的容量瓶中，用甲醇定溶至刻度，得濃度為0.25 mg/mL的混合對照品溶液。

2.1.3 顯色劑的制備 稱取5.0 g三氯化鋁置于100 mL容量瓶中，用無水乙醇定溶至刻度，得5%的三氯化鋁乙醇溶液，備用。

2.1.4 展開劑的配制 分別稱取SDS、正丁醇和正己烷，按質(zhì)量比27∶63∶10混合，加入不同比例的水，超聲5 min，密封靜置24 h，備用。

2.2微乳薄層分析

2.2.1 微乳展開劑含水量的選擇 在SDS-正丁醇-正己烷的質(zhì)量比(27∶63∶10)保持不變的條件下，按表1改變含水量，配制系列微乳液，將點樣后的聚酰胺薄膜在不同微乳液中展開，取出晾干，均勻噴灑顯色劑，366 nm下檢視，當(dāng)微乳展開劑的含水量為75%時，對照品和桑葉桑枝樣品均能達到較好的分離效果，故選擇含水量75%的O/W型微乳液作為展開劑，見表2。

表1 微乳展開劑中不同含水量的選擇

表2 微乳展開劑中不同含水量的展開效果

2.2.2 微乳展開劑中SDS用量的選擇 當(dāng)含水量(75%)，助表面活性劑(正丁醇)-正己烷質(zhì)量比保持不變的條件下，按表3分別取不同量的SDS，配制微乳展開劑，按照“2.2.1”項下的方法展開，366 nm下檢視。當(dāng)SDS用量為2.2 和3.2 g時，對照品和桑葉桑枝樣品的分離都存在拖尾和顯色不清晰的現(xiàn)象，當(dāng)SDS的用量為2.7 g時，對照品和桑葉桑枝樣品均能達到較好的分離效果，因此選擇SDS-正丁醇-正己烷質(zhì)量比為 2.7∶6.3∶1.0,見圖1、2。

表3 微乳展開劑不同SDS含量的選擇

SDS-正丁醇-正己烷=m(2.2∶6.3∶1.0) SDS-正丁醇-正己烷=m(2.7∶6.3∶1.0) SDS-正丁醇-正己烷=m(3.2∶6.3∶1.0)

SDS-正丁醇-正己烷=m(2.2∶6.3∶1.0) SDS-正丁醇-正己烷=m(2.7∶6.3∶1.0) SDS-正丁醇-正己烷=m(3.2∶6.3∶1.0)

2.2.3 微乳展開劑中助表面活性劑種類的選擇 當(dāng)含水量(75%)，SDS-助表面活性劑-正己烷質(zhì)量比為2.7∶6.3∶1.0保持不變的條件下，按表4配制微乳展開劑，按“2.2.1”項下方法展開、檢視，不同助表面活性劑(正丁醇、乙醇及甲醇)對展開效果的影響，當(dāng)助表面活性劑為正丁醇時，對照品和桑葉桑枝樣品均能達到較好的分離效果，因此選擇正丁醇為助表面活性劑，見圖3、4。

2.2.4 微乳展開劑中正丁醇用量的選擇 當(dāng)含水量(75%)，SDS-正己烷質(zhì)量比保持不變的條件下，取不同質(zhì)量的正丁醇，按表5配制展開劑，按“2.2.1”項下方法展開、檢視，當(dāng)正丁醇用量為6.3 g時，對照品和桑葉桑枝樣品均能達到較好的分離效果，因此選擇SDS-正丁醇-正己烷質(zhì)量比為2.7∶6.3∶1.0，見圖5、6。

表4 不同種類助表面活性劑的微乳展開劑

SDS-甲醇-正己烷=m(2.7∶6.3∶1.0) SDS-正丁醇-正己烷=m(2.7∶6.3∶1.0) SDS-乙醇-正己烷=m(2.7∶6.3∶1.0)

表5不同正丁醇用量的微乳展開劑

2.2.5 微乳展開劑中甲酸用量的選擇 當(dāng)含水量(75%)，SDS-正丁醇-正己烷質(zhì)量比為2.7∶6.3∶1.0保持不變的條件下，選擇微乳展開劑-甲酸(9.0∶0.5、9.0∶1.0、9.0∶1.5)為展開劑，按照“2.2.1”項下的方法展開、檢視，當(dāng)V(微乳)∶V(甲酸)=9.0∶1.0時，對照品和桑葉桑枝樣品均能達到較好的分離效果，見圖7、8。

SDS-正丁醇-正己烷=m(2.7∶:5.8∶1.0) SDS-正丁醇-正己烷=m(2.7∶6.3∶1.0) SDS-正丁醇-正己烷=m(2.7∶6.8∶1.0)

SDS-正丁醇-正己烷=m(2.7∶5.8∶1.0) SDS-正丁醇-正己烷=m(2.7∶6.3∶1.0) SDS-正丁醇-正己烷=m(2.7∶6.8∶1.0)

V(微乳液)∶V(甲酸)=9.0∶0.5 V(微乳液)∶V(甲酸)=9.0∶1.0 V(微乳液)∶V(甲酸)=9.0∶1.5

V(微乳液)∶V(甲酸)=9.0∶0.5 V(微乳液)∶V(甲酸)=9.0∶1.0 V(微乳液)∶V(甲酸)=9.0∶1.5

2.3微乳薄層鑒別系統(tǒng)驗證實驗分別吸取10批次不同產(chǎn)地的桑葉桑枝樣品溶液2.5 μL及混合對照品2 μL，點于20 cm×10 cm 聚酰胺薄膜板上，以含水量75%， m(SDS)-m(正丁醇)-m(正己烷)=2.7∶6.3∶1.0，V(微乳液) ∶V(甲酸)=9.0∶1.0 為展開劑，366 nm下檢視。在桑枝桑葉樣品與對照品相應(yīng)的位置上，顯現(xiàn)出顏色相同的斑點，可鑒別出桑葉中綠原酸、蘆丁和桑皮苷A3種成分，以及桑枝中桑辛素、綠原酸、東莨菪內(nèi)酯和桑皮苷A4種成分，見圖9、10。

(注：A.綠原酸；B.蘆丁； C.桑皮苷A)

(注：A.綠原酸；B.蘆?。?C.桑皮苷A)

3 討論

微乳薄層色譜是以微乳液為展開劑的薄層分析法，與傳統(tǒng)的薄層色譜的展開劑相比，得到的斑點更加清晰，且數(shù)目較多，低毒。微乳薄層還具有明顯的熒光增強增敏效應(yīng)，是桑枝桑葉中黃酮類等物質(zhì)定性鑒別較為理想的方法。本實驗對提取溶劑進行了篩選，分別以甲醇、95%乙醇、85%乙醇及70%乙醇為溶劑的超聲和回流2種提取法。結(jié)果顯示，以甲醇為溶劑的2種提取方法得到的提取物中，綠色素含量較大，斑點不清晰、有拖尾；以95%乙醇作為溶劑的2種提取方法得到的提取物中，紅色素含量較大，斑點有拖尾；以70%乙醇作為溶劑的2種提取方法得到的提取物，分離后斑點較少、不清晰；只有以85%乙醇為溶劑的超聲法得到的提取物中，色素含量少，分離后斑點數(shù)多、清晰。同上還考察了以乙酸乙酯、正庚烷、正辛烷、正己烷作為展開系統(tǒng)的油相時，對展開效果的影響，發(fā)現(xiàn)以正己烷為油相的微乳液作為展開劑時，分離效果最好。