趙方圓，李靜媛

(青島農(nóng)業(yè)大學 食品科學與工程學院，山東 青島，266109)

葡萄醋是利用葡萄酒或者葡萄果汁等作為原料發(fā)酵釀造的食醋[1]。葡萄醋中不僅含有白藜蘆醇、花青素等多酚類抗氧化活性成分[2]，具有抗衰老、抗氧化、保護心臟等功效[3～5]，還富含氨基酸、維生素和礦物質(zhì)等，具有保健功能[6]。

傳統(tǒng)葡萄醋發(fā)酵工藝多以固態(tài)發(fā)酵為主，但發(fā)酵周期較長，勞動強度大，占地面積廣，原材料利用率低[7]。新型葡萄醋生產(chǎn)工藝主要是采用液態(tài)發(fā)酵法，通過酒精發(fā)酵和醋酸發(fā)酵，最終得到的產(chǎn)品不但擁有果醋的營養(yǎng)價值，同時兼?zhèn)淦咸丫频娘L格與特征。本研究采用巨峰葡萄為原料，以液態(tài)發(fā)酵技術，參考葡萄酒酒精發(fā)酵工藝中的相關技術來改進葡萄醋的釀造工藝，以期最大化地增加葡萄醋中的營養(yǎng)成分和改善風味。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

巨峰鮮食葡萄，購于青島大潤發(fā)超市；活性干酵母，購于法國萊蒙特公司；巴氏醋桿菌，購于北京豫鼎鑫捷科技有限公司。

1.1.2 試劑

酒石酸、DL-蘋果酸、乳酸、檸檬酸、琥珀酸標準品、白藜蘆醇和沒食子酸標準品購自美國Sigma公司；乙腈購自德國merck公司；果膠酶、葡萄糖、酵母膏、瓊脂粉、NaOH、CaCO3、H2SO3等常規(guī)試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

液相色譜儀，日本島津公司；PEN3型便攜式電子鼻，德國Airsense公司；紫外可見分光光度計，尤尼柯(上海)儀器有限公司；電子分析天平，奧豪斯國際貿(mào)易(上海)有限公司；TGL-16M高速臺式冷凍離心機，上海安亭科學儀器廠；pH計，奧豪斯儀器(上海)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 釀造方法

生產(chǎn)工藝流程：

葡萄→除梗、破碎→入罐→浸漬(12 h)→酒精發(fā)酵→分離、壓榨→調(diào)整酒精度(8%)→醋酸發(fā)酵(30 ℃)→過濾、離心→滅菌→成品。

在浸漬溫度、酒精發(fā)酵溫度2個環(huán)節(jié)進行了對比試驗，參數(shù)設置見表1。

表1 不同葡萄醋釀造工藝的參數(shù)設定Table 1 Parameter setting of different grape vinegar brewing process

葡萄破碎：稱取1 kg巨峰葡萄，經(jīng)過除梗破碎后，裝入到2.5 L玻璃罐中，添加30 mg/L SO2，20 mg/L 果膠酶。

酒精發(fā)酵：葡萄破碎浸漬結(jié)束恢復常溫后，將活化后的酵母加入罐中進行發(fā)酵。每天測定其溫度、比重和糖度，當比重和糖度不再變化時，發(fā)酵結(jié)束。

醋酸發(fā)酵：將部分原酒酒度調(diào)至8%，接入5% 醋酸發(fā)酵種子液，于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中靜止培養(yǎng)，隨時測定醋酸含量的變化，直至醋酸含量不再增加。

后處理：將發(fā)酵完成的原醋于70 ℃下滅菌10 min， 離心(6 000 r/min, 10 min)得到澄清葡萄醋樣品。

1.3.2 檢測方法

電子鼻檢測：準確量取10 mL不同樣品，注入進樣瓶中密封30 min后，在室溫(20 ℃)條件下使用電子鼻進行檢測。電子鼻檢測條件：采樣時間為3 s/組，檢測時間為60 s，傳感器自清洗時間為180 s。電子鼻傳感器所對應的香氣類型見表2。

表2 電子鼻傳感器對應的香氣類型Table 2 Aroma types corresponding to sensors of E-nose

色度的測定：參考陳孜銅等[8]方法測定色度。

總酸的測定：參考國標GB/T 15038—2006[9]。

酒精度的測定：參考國標GB/T 10345—2007[10]。

可溶性固形物的測定：使用手持折光儀進行測定。

總酚的測定：采用福林-肖卡試劑比色法[11]測定。

有機酸的測定：利用高效液相色譜，參考陸燕等[12]方法。色譜條件：色譜柱為C18柱，流動相為乙腈-0.01 mol/L NH4H2PO4(2∶98)溶液，用磷酸調(diào)pH值至2.70。流速：1.0 mL/min，進樣量為30 μL，檢測波長210 nm，柱溫25 ℃，流動相使用前用0.45 μm濾膜過濾，超聲脫氣。

白藜蘆醇的測定：利用高效液相色譜，參考劉慶等[13]方法。色譜條件：色譜柱為C18柱，流動相為乙腈∶水 =70∶30。流速：1.0 mL/min，進樣量為10 μL，檢測波長306 nm，柱溫30 ℃，流動相使用前超聲脫氣。

感官評價：選取10名有經(jīng)驗的品嘗員對不同工藝釀造得到的葡萄醋產(chǎn)品進行感官評價得分，感官評定標準如表3所示。

表3 感官評定標準Table 3 The standard of sensory assessment

1.3.3 數(shù)據(jù)分析

每組設置3個平行，使用Microsoft Excel、WinMuster 等軟件處理實驗數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同釀造工藝對于酒精發(fā)酵和醋酸發(fā)酵的影響

按照1.3.1設定的3種釀造工藝發(fā)酵葡萄醋，獲得酒精發(fā)酵和醋酸發(fā)酵的相關數(shù)據(jù)如表4所示。

表4 不同釀造工藝對酒精發(fā)酵和醋酸發(fā)酵的影響Table 4 Effects of different fermentation processes on alcohol fermentation and acetic acid fermentation

由于2號酒精發(fā)酵溫度低，酵母啟動酒精發(fā)酵的時間長，其酒精發(fā)酵的時間也較長，但從表4來看，3種樣品在最終酒度上無明顯差異。在醋酸發(fā)酵方面，可以明顯看出，進行過高溫浸漬的2和3號樣品，雖然醋酸發(fā)酵時間略長于常溫浸漬的1號樣品，但最終產(chǎn)酸量卻明顯高于1號樣品。分析原因可能是高溫浸漬樣品中較高濃度的酚類物質(zhì)抑制了醋酸菌的活動，使其發(fā)酵時間延長，但較長的發(fā)酵時間提高了醋酸的產(chǎn)量。

2.2 不同釀造工藝的葡萄醋樣品的電子鼻檢測分析

2.2.1 電子鼻對不同葡萄醋樣品中香氣成分的特征響應

利用電子鼻對1～3號葡萄醋樣品進行檢測。檢測結(jié)果如圖1所示。

圖1 1～3號葡萄醋樣品傳感器響應圖Fig.1 Graphs of response of 10 sensors to aroma of 1～3 grape vinegar sample

由圖1可以看出， 1～3葡萄醋樣品的傳感器響應譜圖曲線形態(tài)分布很接近，說明不同的釀造工藝并沒有根本改變葡萄醋的香氣類型。3種葡萄醋中香氣成分較明顯的，依次為芳香成分、有機硫化物(9號傳感器)、醇類(8號傳感器)、甲烷(6號傳感器)、硫化物(7號傳感器)和氮氧化合物(2號傳感器)。從信號強度來看，常溫浸漬、常溫發(fā)酵的1號樣品的香氣濃度明顯高于其他兩種高溫浸漬工藝發(fā)酵的2號和3號樣品。由此可知高溫浸漬的釀造工藝，會導致葡萄汁香氣成分散失較多，從而降低了葡萄醋的香氣。

2.2.2 不同葡萄醋樣品的PCA主成分分析

圖2為不同釀造工藝的葡萄醋香氣的主成分分析(principal component analysis，PCA)圖中不同顏色的橢圓分別代表3種釀造工藝的葡萄醋樣品的數(shù)據(jù)采集點。通過PCA分析知，第一主成分區(qū)分貢獻率為99.77%，第二主成分區(qū)分貢獻率為0.23%，第一、第二主成分總的區(qū)分貢獻率為100.00%，則這兩個主成分基本代表了樣品的主要特征信息。通過圖2主成分PC1和PC2兩個主軸上看，3種食醋分布在不同區(qū)域，能很好地被區(qū)分開。說明不同的釀造工藝對葡萄醋香氣產(chǎn)生明顯影響。

圖2 不同釀造工藝的葡萄醋香氣的PCA主成分分析圖Fig.2 PCA analysis for aroma of different brewing process of grape vinegar

2.2.3 不同葡萄醋樣品的LDA線性判別分析

由圖3發(fā)現(xiàn)，按照線性判別分析法(linear discrimination analysis， LDA)，第一主成分區(qū)分貢獻率高達100.00%，基本代表了樣品的主要特征信息。通過LDA分析，3種食醋非常集中地分布在3個不同區(qū)域，說明不同的釀造工藝釀出的葡萄醋具有明顯差異，能夠被明顯區(qū)分。

圖3 不同釀造工藝的葡萄醋的LDA線性判別分析Fig.3 LDA analysis for aroma components of different brewing process of grape vinegar

2.3 不同釀造工藝對葡萄醋樣品營養(yǎng)成分的影響

2.3.1對可溶性固形物含量的影響

對1～3號葡萄醋樣品中可溶性固形物進行測定，結(jié)果如圖4所示。

圖4 不同釀造工藝對葡萄醋中可溶性固形物含量的影響Fig.4 Effects of different brewing processes on the content of soluble solids in grape vinegar

由圖4可知，使用低溫發(fā)酵高溫浸漬工藝的2號樣品中可溶性固形物含量明顯高于其他2組常溫發(fā)酵樣品。由此推測：較低的發(fā)酵溫度，可能降低了酵母菌代謝消耗所需能量，從而減少可溶性固形物(如葡萄糖或果糖)的損失。此外，同樣是常溫發(fā)酵的1號樣品和3號樣品，高溫浸漬的3號樣品中可溶性固形物的含量較高。由此得出：較高的浸提溫度可以從葡萄汁中浸提出更多可溶性物質(zhì)，從而最終葡萄醋產(chǎn)品中的可溶物含量也更高。

2.3.2 對色度、多酚、白藜蘆醇含量的影響

利用紫外分光光度儀、高效液相色譜儀對1～3號葡萄醋樣品的色度、多酚、白藜蘆醇含量進行測定，結(jié)果見表5。

表5 不同釀造工藝中的葡萄醋色度、多酚和白藜蘆醇含量Table 5 Effects of different brewing processes on chromaticity, polyphenol and resveratrol content in grape vinegar

葡萄醋色度值的大小，主要是由葡萄醋中的酚類物質(zhì)如花色素苷、單寧等決定，酚類物質(zhì)含量越高，葡萄醋的色度也就越高。通過表5可以看出：對于色度來說，高溫浸漬、低溫發(fā)酵樣品(2號)>常溫浸漬、常溫發(fā)酵樣品(1號)>高溫浸漬、常溫發(fā)酵樣品(3號)，因此高溫浸漬、低溫發(fā)酵最有利于葡萄醋色度的提高。由圖2還可以看出，多酚和白藜蘆醇的含量由多到少依次是：高溫浸漬、低溫發(fā)酵樣品(2號)>高溫浸漬、常溫發(fā)酵樣品(3號)>常溫浸漬、常溫發(fā)酵樣品(1號)。這與色度結(jié)果的規(guī)律基本吻合，可以得出結(jié)論：酒精發(fā)酵過程中，使用高溫浸漬的方法可以更多地融入葡萄皮中的酚類物質(zhì)，色度也越深；而較低發(fā)酵的溫度，延長了酒精發(fā)酵的時間，這可能也會導致酚類物質(zhì)含量的明顯增加。

2.3.3 對有機酸種類和含量的測定及分析

通過液相色譜儀對酒石酸、DL-蘋果酸、乳酸、檸檬酸和琥珀酸5種有機酸標準品進行色譜分析獲得圖5。色譜圖中存在6個主峰，從左至右依次為酒石酸、L-蘋果酸、乳酸、檸檬酸、D-蘋果酸、琥珀酸。由于葡萄醋中存在的蘋果酸主要為L-蘋果酸，所以本次研究只對L-蘋果酸進行分析。通過對圖5的分析，確定5種有機酸的出峰時間。將1～3號樣品進行色譜分析，以樣品3的色譜圖(圖6)為例，根據(jù)出峰時間，可知圖6中峰1為酒石酸、峰2為L-蘋果酸、峰3為乳酸、峰4為檸檬酸、峰5為琥珀酸。

圖5 5種有機酸標準品色譜圖Fig.5 The chromatograms of 5 kinds of organic acid standard

圖6 3號樣品中有機酸色譜圖Fig.6 The organic acid chromatogram of No.3 sample

通過對1～3號樣品的色譜圖分析，根據(jù)5種有機酸標準品的出峰時間及線性回歸方程(R2=0.996 1～0.999)，計算出3種葡萄醋樣品中5種有機酸的含量如圖7所示。高溫浸漬的2號和3號樣品各項有機酸含量明顯高于常溫浸漬的1號樣品。分析原因可能是高溫浸漬使更多有機酸溶解到葡萄汁中，從而最終葡萄醋樣品中有機酸含量較高。

圖7 不同釀造工藝對葡萄醋中5種有機酸濃度的影響Fig.7 Effects of different brewing processes on the concentration of five organic acids in vinegar

此外，低溫發(fā)酵、高溫浸漬的2號樣品中乳酸和檸檬酸含量均高于常溫發(fā)酵、高溫浸漬的3號樣品，酒石酸和蘋果酸低于3號樣品，琥珀酸差異不明顯。分析原因可能是低溫發(fā)酵過程中，一部分酸如酒石酸等，會由于發(fā)酵溫度較低導致溶解度下降。由于酒石酸和蘋果酸同屬于二元酸，在口感上顯得尖酸刺口，過多的蘋果酸和酒石酸會導致葡萄醋口感粗糙，不夠柔和。由此推測，2號樣品在口感上會優(yōu)于3號樣品。

2.4 不同釀造工藝的葡萄醋樣品的質(zhì)量感官評定

對3種葡萄醋樣品的質(zhì)量感官評價見表6。常溫浸漬、常溫發(fā)酵的1號樣品的香氣最濃郁、厚重，但酸感較弱、較平淡。通過高溫浸漬的2號和3號樣品風味口感較常溫浸漬(1號)樣品更豐富，多樣。但3號樣品的口感略顯酸澀、較粗糙，且色澤較暗淡。而低溫發(fā)酵的2號樣品在口感的柔和度和協(xié)調(diào)性上要優(yōu)于常溫發(fā)酵的1號和3號樣品。因此2號葡萄醋樣品的感官評價得分最高，質(zhì)量最好。

表6 不同釀造工藝葡萄醋樣品質(zhì)量感官評定表Table 6 The quality sensory evaluation table of different brewing process grape vinegar samples

3 結(jié)論

本研究以巨峰葡萄為原料，參考葡萄酒酒精發(fā)酵工藝中的相關技術，采用不同的浸漬溫度和酒精發(fā)酵溫度的釀造方法來改進葡萄醋的發(fā)酵工藝。結(jié)果表明：采用電子鼻系統(tǒng)中的PCA和LDA分析，發(fā)現(xiàn)這2種方法均能準確分區(qū)開3種不同釀造工藝的葡萄醋樣品，由此說明不同的釀造工藝確實對葡萄醋的香氣產(chǎn)生了較大的影響。對葡萄醋樣品中各成分的進一步分析、品評獲得采用高溫浸漬、低溫發(fā)酵的葡萄醋樣品：含有最多的可溶性固形物及酚類物質(zhì)，具有較高的營養(yǎng)價值；各類有機酸含量適宜——口感較柔和的乳酸含量較高，而口感較尖銳的蘋果酸、酒石酸含量較低；具有最柔和的口感和酸爽的口味，且香氣宜人。由此得出，與常溫浸漬和常溫酒精發(fā)酵工藝相比，高溫浸漬、低溫酒精發(fā)酵的葡萄醋釀造工藝可以較好地實現(xiàn)葡萄醋中的營養(yǎng)成分的增加和風味的改善。