王惠敏，戶佩，蔡甜甜，徐淑麗，洪晶,汪少蕓

(福州大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院，福建 福州，350108)

自由基理論指出，活性氧自由基及其他自由基會(huì)對(duì)DNA、蛋白質(zhì)和其他大分子如脂類產(chǎn)生氧化損傷[1],還有誘發(fā)多種疾病如糖尿病、心血管疾病甚至癌癥等的發(fā)生[2]。因而抗氧化劑對(duì)清除人體自由基以及預(yù)防和治療各類疾病具有重要意義。目前市場上以化學(xué)合成的抗氧化劑如BHT、BHA應(yīng)用最為廣泛，抗氧化效果良好，但有研究表明BHT、BHA等化學(xué)合成的抗氧化劑對(duì)人體肝臟、脾肺有潛在的毒性作用[3]，因而其使用量有嚴(yán)格限制。所以開發(fā)高效無毒的抗氧化劑已成為國內(nèi)外的研究熱點(diǎn)。

抗氧化肽具有清除自由基活性和抑制脂質(zhì)過氧化的作用，同時(shí)抗氧化肽又可以為人體提供額外的營養(yǎng)價(jià)值。目前已有很多研究者從各類動(dòng)植物源蛋白中提取并純化得到特定氨基酸序列的抗氧化肽，如HIMANI等[4]從珍珠栗蛋白中提取并純化得到抗氧化肽SDRDLLGPNNQYLPK；趙曉蕾等[5]從大米渣中提取并純化得到氨基酸序列為LQPY的抗氧化肽；DAVALOS等[1]通過水解雞蛋白得到抗氧化肽YAEERYPIL，具有良好的活性氧自由基清除活性。

本文以胡蘿卜籽蛋白為原料，通過酶解法制備獲得較高活性的抗氧化肽，采用Sephadex G-25 凝膠過濾色譜和反向高效液相色譜對(duì)胡蘿卜籽抗氧化肽進(jìn)行分離純化，測(cè)定其氨基酸序列，并對(duì)其抗氧化活性進(jìn)行了研究。研究結(jié)果為胡蘿卜籽的綜合開發(fā)利用提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與試劑

胡蘿卜籽，購于福州種子市場；堿性蛋白酶，購于Notlas生物科技有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)，2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)，購于美國Sigma公司；谷胱甘肽(GSH)，乙腈，三氟乙酸，購于國藥集團(tuán)；Sephadex G-25常壓凝膠色譜柱，購于美國GE Healthcare公司；半制備型C18高效液相色譜柱，購于上海通威公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

數(shù)顯恒溫水浴搖床(HH-4)，國華電器有限公司；高速冷凍離心機(jī)(XZ21K)，長沙湘智離心機(jī)儀器有限公司；pH計(jì)(pH700),美國Eutech公司；自動(dòng)收集器(BS-160A),上海滬西分析儀器廠有限公司；真空冷凍干燥器(FD-1C-50)，北京博醫(yī)康試驗(yàn)儀器有限公司；高效液相色譜系統(tǒng)(LC-20A)，日本島津；質(zhì)譜儀(Aglient 6500)，美國安捷倫科技有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 胡蘿卜籽蛋白含量的測(cè)定及提取

采用凱式定氮法測(cè)定胡蘿卜籽中總蛋白含量，參照戶佩等[6]研究得出的最優(yōu)提取工藝制備胡蘿卜籽蛋白。

1.3.2 胡蘿卜籽抗氧化肽的制備

以胡蘿卜籽蛋白為原料，利用堿性蛋白酶進(jìn)行酶解制備抗氧化肽。酶解工藝流程為：胡蘿卜籽蛋白溶液→調(diào)pH→酶解→滅酶→離心取上清→真空冷凍干燥→抗氧化肽。

配制質(zhì)量濃度為5.28%的蛋白質(zhì)溶液，調(diào)pH為10.0，添加酶量為419.36 U/g，45 ℃水浴酶解3.5 h，酶解結(jié)束后于沸水浴滅酶10 min，迅速冷卻至室溫，于4 ℃條件下12 000 r/min離心30 min。

1.3.3 胡蘿卜籽抗氧化肽的分離純化與結(jié)構(gòu)鑒定

1.3.3.1 Sephadex G-25 凝膠過濾色譜分離

將Sephadex G-25凝膠進(jìn)行預(yù)處理后裝柱(大小Φ100×2.0 cm),抗氧化肽凍干粉以超純水復(fù)溶，配制為50 mg/mL的溶液，經(jīng)0.22 μm微濾膜過濾后上樣，以超純水為流動(dòng)相以0.3 mL/min的速度洗脫，每10 min收集1管。洗脫液于220nm波長處測(cè)定吸光值，繪制洗脫曲線，收集各洗脫組分，真空冷凍干燥備用。

1.3.3.2 反相高效液相色譜(RP-HPLC)

將Sephadex G-25分離組分中有較高活性的組分以超純水復(fù)溶，經(jīng)0.22μm微濾膜過濾，通過半制備型C18反相高效液相色譜柱(10 mm×250 mm)進(jìn)行進(jìn)一步分離純化，采用分析型C18反相高效液相色譜柱對(duì)組分進(jìn)行純度鑒定。液相色譜洗脫條件：洗脫液A為超純水(含0.05%體積分?jǐn)?shù)三氟乙酸)；洗脫液B為乙腈(含0.05%體積分?jǐn)?shù)三氟乙酸)；0～5 min，5%乙腈水溶液；5～55 min，5%～40%乙腈水溶液；55～65 min，40%乙腈水溶液；流速為2 mL/min;檢測(cè)波長為220 nm。收集具有較高活性的洗脫峰，真空冷凍干燥備用。

1.3.3.3 氨基酸序列測(cè)定與分析

經(jīng)RP-HPLC純化后的樣品，采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用法(HPLC-ESI-Q-TOF/MS)進(jìn)行氨基酸序列測(cè)定及分析。色譜條件為：色譜柱為BEH C18(Φ2.1 mm×100 mm)；流動(dòng)相為100%乙腈；流速：0.3 mL/min；檢測(cè)波長為220nm。質(zhì)譜參數(shù)：離子方式為ESI+；錐孔電壓為40 V；毛細(xì)管電壓為3.5 kV；檢測(cè)器電壓為1 700 V；碰撞能量為6 eV；質(zhì)量范圍為200～3 000m/z。

1.3.4 抗氧化活性檢測(cè)

1.3.4.1 DPPH自由基清除活性檢測(cè)

DPPH自由基清除活性參考ASOODEH等[7]描述的方法稍作修改。以無水乙醇配制DPPH溶液(0.1 mmol/L)，取500μL樣品溶液與等體積的DPPH自由基溶液混合，常溫避光反應(yīng)30 min，于517 nm波長處測(cè)定吸光值。分別以水和GSH為空白對(duì)照和陽性對(duì)照，同時(shí)設(shè)置內(nèi)參對(duì)照組。DPPH自由基清除率計(jì)算公式如下：

(1)

式中：Ai為樣品組(自由基+樣品)；Aj為內(nèi)參對(duì)照組(乙醇+樣品)；A0為空白對(duì)照組(自由基+水)。

1.3.4.2 ABTS自由基清除活性檢測(cè)

ABTS自由基清除活性參照AHMED等[8]報(bào)道的方法進(jìn)行測(cè)定。7 mmol/L的ABTS溶液與2.45 mmol/L 的過硫酸鉀溶液以體積比1∶1混合，室溫避光反應(yīng)12～16 h產(chǎn)生ABTS自由基離子，以磷酸鹽溶液(5 mmol/L，pH 7.4)稀釋至于734 nm波長處的吸光值為0.7±0.02，將稀釋液與樣品溶液等體積混勻反應(yīng)10 min后于734 nm波長處測(cè)定吸光值，分別以水和GSH為空白對(duì)照和陽性對(duì)照。ABTS自由基清除率計(jì)算公式為：

(2)

式中：As為樣品組；A0為空白對(duì)照組。

1.3.4.3 超氧陰離子自由基清除活性檢測(cè)

超氧陰離子自由基清除活性參考SISWOYO等[9]描述的方法。采用鄰苯三酚法進(jìn)行測(cè)定。樣品與Tris-HCl緩沖液(50 mmol/L,pH 8.3)等體積(400 μL)混勻，于25 ℃條件下靜置10 min，加入100 μL的焦棓酸溶液(1.5 mmol/L,溶于1.0 mmol/L的HCl中)反應(yīng)5 min。于320 nm處測(cè)定吸光值，每隔30 s測(cè)定1次，分別以水和GSH作為空白對(duì)照和陽性對(duì)照。超氧陰離子自由基清除活性的計(jì)算公式如下：

超氧陰離子自由基清除率/%=

(3)

式中:ΔAo/min為空白組的吸光值曲線斜率；ΔAs/min為樣品組的吸光值曲線斜率。

1.3.4.4 抑制亞油酸過氧化能力

亞油酸自氧化體系建立參照ZHANG等[10]的方法稍作修改，以無水乙醇配制亞油酸(體積分?jǐn)?shù)為2.5%),將1.0 mL的多肽樣品(1.0 mg/mL)、1.0 mL亞油酸、2.0 mL磷酸鹽溶液(50 mmol/L, pH 7.0)和1.0 mL超純水置于具塞試管中，于37 ℃條件下，避光反應(yīng)7 d，分別以水和Vc作為空白對(duì)照和陽性對(duì)照。每隔1 d測(cè)定1次亞油酸的氧化程度，亞油酸氧化程度依照硫氰酸鉀(FTC)法[11]測(cè)定。

2 結(jié)果與討論

2.1 胡蘿卜籽蛋白含量測(cè)定結(jié)果

采用凱式定氮法測(cè)得胡蘿卜籽中總蛋白含量為(23.57±0.14)%。

2.2 Sephadex G-25 凝膠過濾色譜分離

胡蘿卜籽抗氧化肽凍干粉用超純水復(fù)溶，采用Sephadex G-25 凝膠過濾色譜初步分離，分離后的洗脫峰曲線及各洗脫峰的抗氧化活性如圖1所示[12]，胡蘿卜籽抗氧化肽粗品被分為4個(gè)組分(F1，F(xiàn)2，F(xiàn)3，F(xiàn)4)，其中組分F1的DPPH自由基清除活性最高，組分F3次之。由于組分F1收集液顏色較深，推測(cè)其中可能含有其他物質(zhì)具有較高的抗氧化活性，而組分F3在柱中保留時(shí)間較長，其分子質(zhì)量較小，有報(bào)道指出，小分子多肽具有更強(qiáng)的抗氧化活性[13]，故收集組分F3進(jìn)行進(jìn)一步的高效液相色譜分離。

A-抗氧化肽粗品Sephadex G-25色譜圖;B-各組分DPPH自由基清除率圖1 抗氧化肽粗品Sephadex G-25色譜圖以及各組分DPPH自由基清除率Fig.1 Separation of peptide by Sephadex G-25 and DPPH radical scavenging activity of fractions obtained by gel filtration chromatography

2.3 組分F3高效液相色譜分離

采用半制備型C18柱RP-HPLC色譜對(duì)組分F3進(jìn)一步分離純化，結(jié)果見圖2。

組分F3成分復(fù)雜，對(duì)各洗脫峰進(jìn)行活性測(cè)定，結(jié)果表明其中有2個(gè)洗脫峰活性較高，分別將其命名為F3-a、F3-b。當(dāng)樣品質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL時(shí), F3-a和F3-b的DPPH自由基清除率分別為(90.66±2.71)%、(84.47±0.19)%。此外，經(jīng)分析型C18RP-HPLC進(jìn)行純度鑒定得F3-a和F3-b呈單一峰(圖3)，說明已達(dá)到色譜純，故收集F3-a和F3-b兩個(gè)洗脫組分進(jìn)行氨基酸序列分析。

圖2 組分F3高效液相色譜圖Fig.2 RP-HPLC chromatogram of component F3

圖3 組分F3-a和F3-b純度鑒定Fig.3 Evaluation the purity of fraction F3-a and F3-b from RP-HPLC

2.4 抗氧化肽的分子質(zhì)量及序列測(cè)定

采用液質(zhì)聯(lián)用儀對(duì)組分F3-a和F3-b進(jìn)行分子質(zhì)量及氨基酸序列的測(cè)定，質(zhì)譜圖結(jié)果如圖4所示。

由質(zhì)譜圖分析得：F3-a為一個(gè)六肽，氨基酸序列為Lys-Asp-Asn-Phe-Leu-Phe(KDNFLF),分子質(zhì)量為782.32 Da；F3-b為一個(gè)二肽，氨基酸序列為Leu-Phe(LF),分子質(zhì)量為278.16 Da。有研究指出，含2～20個(gè)氨基酸的活性肽可以穿過膜屏蔽并在組織水平上發(fā)揮多種生物活性[14]。分子質(zhì)量越小越容易穿過屏障，靠近缺電子基團(tuán)，增強(qiáng)肽的活性[15-16]。有報(bào)道表明分子質(zhì)量小于1 kDa的肽表現(xiàn)出較強(qiáng)抗氧化活性[17]，JE等[18]以阿拉斯加鱈魚蛋白為原料進(jìn)行酶解得到的抗氧化肽，發(fā)現(xiàn)分子質(zhì)量小于1 kDa的多肽抗氧化活性最強(qiáng)。本文從胡蘿卜籽蛋白中分離鑒定得到的兩條肽鏈KDNFLF和LF分子質(zhì)量均小于1 kDa，因而可能具有較強(qiáng)的抗氧化活性。此外，抗氧化肽的活性大小也受其氨基酸組成的影響，有研究認(rèn)為，一些具有特殊結(jié)構(gòu)的氨基酸對(duì)抗氧化活性貢獻(xiàn)最大，如芳香族氨基酸(Phe,Tyr,Trp),側(cè)鏈含咪唑基的組氨酸(His),以及含硫的氨基酸(Cys,Met)等[11,19-20]。本文中的2條多肽均在C端含有一個(gè)Phe, Phe側(cè)鏈含有苯環(huán)使得Phe具有供氫能力，增強(qiáng)了多肽的抗氧化活性。

A-KDNFLF;B-LF圖4 抗氧化肽質(zhì)譜圖及結(jié)構(gòu)式Fig.4 Mass spectra of antioxidant peptides and their structural formula

2.5 合成肽的體外抗氧化活性檢測(cè)

由質(zhì)譜鑒定得到的抗氧化肽KDNFLF和LF委托上海吉爾生化公司合成，其純度達(dá)98%以上。以還原型谷胱甘肽(GSH)為陽性對(duì)照，考察KDNFLF和LF的抗氧化活性，結(jié)果見圖5。

A-ABTS自由基清除活性；B-超氧陰離子自由基清除活性;C-抑制亞油酸氧化能力圖5 抗氧化肽的活性表征Fig.5 Activity characterization of antioxidant peptides

圖5-A、圖5-B分別為不同濃度多肽對(duì)ABTS自由基及超氧陰離子自由基的清除活力，多肽對(duì)自由基的清除活性均具有濃度依賴性，濃度增大抗氧化活性也隨之增加。結(jié)果表明與KDNFLF相比，LF具有更強(qiáng)的抗氧化活性。LF的ABTS自由基清除率為(87.38±0.25)%(250 μg/mL)，活性接近陽性對(duì)照GSH(93.21±0.46)%，超氧陰離子自由基清除率為(61.84±0.029)%(2 mg/mL)。SUETSUNA等[21]對(duì)抗氧化活性肽段YFYPEL進(jìn)行不同結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)，發(fā)現(xiàn)二肽EL的活性要高于原活性肽段，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與之相似。這可能是因?yàn)檩^大分子質(zhì)量的多肽與自由基反應(yīng)時(shí)存在空間位阻，導(dǎo)致多肽的抗氧化活性下降。KDNFLF的C端含有LF肽段，說明LF肽段組合在自由基清除中起重要作用，與長肽鏈相比，短肽具有更強(qiáng)的抗氧化活性。

圖5-C為抑制亞油酸自氧化能力的測(cè)定結(jié)果，由圖可知，在第2天到第7天肽LF對(duì)亞油酸的氧化抑制效果微弱，與空白組無顯著性差異(P>0.05),而肽KDNFLF幾乎不具備脂質(zhì)過氧化抑制能力。有研究指出疏水性氨基酸能夠加強(qiáng)肽與脂質(zhì)中自由基的相互作用，阻斷脂質(zhì)自氧化的鏈?zhǔn)椒磻?yīng)[21]。本研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果中，LF為疏水性多肽，脂質(zhì)過氧化抑制能力卻較弱。說明抗氧化肽對(duì)脂質(zhì)過氧化的抑能力除與肽的疏水性有關(guān)外，還與氨基酸組成和順序有關(guān)。

3 結(jié)論與展望

本文以胡蘿卜籽蛋白為原料，以DPPH自由基清除率為指標(biāo)，采用堿性蛋白酶進(jìn)行酶解制得抗氧化肽；通過Sephadex G-25 凝膠過濾色譜、半制備型RP-HPLC對(duì)制得的抗氧化肽進(jìn)行分離純化，最終篩選出2個(gè)抗氧化肽F3-a和F3-b。利用液質(zhì)聯(lián)用儀對(duì)F3-a和F3-b進(jìn)行分子質(zhì)量及氨基酸序列測(cè)定，測(cè)定結(jié)果為：F3-a，序列為Lys-Asp-Asn-Phe-Leu-Phe(KDNFLF),分子質(zhì)量為782.32 Da；F3-b，序列為Leu-Phe(LF),分子質(zhì)量為278.16 Da。通過ABTS自由基清除率和超氧陰離子自由基清除率2個(gè)指標(biāo)檢測(cè)2個(gè)肽的抗氧化活力，同時(shí)考察了2個(gè)肽的脂質(zhì)過氧化抑制能力。結(jié)果表明LF和KDNFLF均具有較強(qiáng)的自由基清除活性，LF表現(xiàn)出微弱的脂質(zhì)過氧化抑制效果。LF的抗氧化活性高于KDNFLF，說明肽段LF組合在抗氧化中起重要作用。

本文僅研究了胡蘿卜籽抗氧化肽的體外模型的抗氧化活力，可進(jìn)一步將純化肽進(jìn)行動(dòng)物體內(nèi)模型試驗(yàn)，更全面體現(xiàn)抗氧化肽的抗氧化活力，為胡蘿卜籽抗氧化肽在醫(yī)藥及食品中的應(yīng)用提供一定的科學(xué)依據(jù)。