楊可，康佳木，劉柳，黨輝，胡新中

(陜西師范大學 食品工程與營養(yǎng)科學學院，陜西 西安，710119)

酵子作為一種復合菌種發(fā)酵劑，大量用于面包和饅頭等的發(fā)酵[1]。隨著酵子的感官和營養(yǎng)質量的改善，工業(yè)烘烤和饅頭生產中酵子的使用越來越受到重視。酵子中微生物的種類和數量對發(fā)酵產品的營養(yǎng)品質和保質期有著重要影響，完整地解析酵子中微生物菌群多樣性，對有效利用酵子中的有益菌群，防止酵子中有害菌群滋生以及提高酵子的質量和安全具有重要意義[2-5]。

國外主要集中于酵子中微生物菌群以及優(yōu)勢菌種對酵子營養(yǎng)成分和發(fā)酵機理的研究[6]。LATTANZI等[7]研究表明意大利酵子中Lactobacillussanfranciscensis和Saccharomycescerevisiae為其優(yōu)勢菌種。CORSETTI等[8]也從酵子中分離出Lactobacillusalimentarius菌種。我國對于酵子的深入研究及應用還處于初級階段，吳斯日古冷[9]對內蒙古地區(qū)微生物多樣性進行了研究。陳軍麗[10]研究表明河南地區(qū)中植物乳桿菌和嗜熱鏈球菌對面團的持氣性能起著重要作用。張國華等[11]研究了我國華東、華北、華中、東北及西北地區(qū)的酵子，且不同地區(qū)基質微生物菌群結構有所不同，并影響了產品的營養(yǎng)品質。陜西關中區(qū)域特色的酵子研究較少，本文以陜西關中地區(qū)酵子為原料，進行Illumina PE250測序及代謝組學分析，對酵子中微生物菌群結構及代謝產物進行了分析，解析關中地區(qū)酵子中微生物多樣性，對酵子中有害微生物的防控具有重要意義，為進一步開展和利用酵子中微生物資源提供了研究基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

DNA基因組提取試劑盒，QIAGEN公司；PCR擴增試劑盒，北京天根生化科技有限公司；PCR引物，上海生工生物工程公司；相關生理生化試驗中所用試劑均為進口或國產分析純。

1.2 儀器與設備

ABI Gene Amp?9700 型號擴增儀，美國ABI公司；CFX型號凝膠成像系統(tǒng)，Bio-RAD公司生產；GCMGU型號水平電泳儀，大連競邁科技有限公司；LDZX-30KBS型立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠；Agilent 7890B型氣相色譜儀，美國Agilent公司；Pegasus HT型飛行時間質譜儀，美國LECO公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備與采集

樣品采自陜西省關中平原大荔和武功2個地區(qū)的酵子。樣品均為手工制作，取500 g小麥面粉室溫發(fā)酵過夜而成。人工采樣后對樣品進行編號后立即放入無菌試劑瓶中在-20 ℃下保存。

1.3.2 總DNA的提取

參考ZHANG等[6]提取DNA的方法對酵子中DNA進行提取，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測抽提后的基因組DNA。

1.3.3 Illumina PE250測序(16S和ITS測序)

本試驗以10 ng總DNA稀釋液作為PCR擴增反應模板進行目的片段的擴增，以515F-907R作為引物對細菌16S rRNA基因的V4～V5區(qū)進行擴增。以ITS1F-ITS2R為引物對真菌ITS1-ITS2區(qū)域進行擴增。擴增后，用2 mL PCR產物來驗證2%瓊脂糖凝膠電泳擴增是否成功。隨后用AxyPrep DNA凝膠回收PCR產物，Tris-HCl洗脫后用2%瓊脂糖電泳檢測。將PCR產物用QuantiFluorTM-ST進行檢測定量，使用NEB Next Ultra DNA建庫試劑盒進行文庫構建，最后用Hisep PE250執(zhí)行測序。

1.3.4 代謝產物分析

采用蒸餾萃取(SDE)技術富集發(fā)酵饅頭中的揮發(fā)性物質，利用氣相色譜-飛行時間質譜(GC-TOFMS)技術進行檢驗，分析不同地區(qū)酵子發(fā)酵饅頭中揮發(fā)性物質的差異。參考蘇東民等[12]對饅頭樣品進行制作的同時進行蒸餾萃取，然后將樣品用于GC-TOFMS分析。色譜條件為色譜柱：J&W DB-5石英毛細管柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)；使用氦氣作為載氣，前入口吹掃流速為3 mL/min，通過柱的氣體流速為1 mL/min；升溫程序：50 ℃保持1 min，以10 ℃/min升至300 ℃，保持14 min；使用氦氣作為載氣流速為1.2 mL/min，壓力2.4 kPa，進樣量1 μL，分流比10∶1。質譜條件為注射、傳輸線和離子源的溫度分別為280、270、220 ℃。電子撞擊模式下能量為70 eV；質量掃描范圍m/z50～500；溶劑延遲時間為460 s，以20張光譜每秒的速率掃描，使用峰面積歸一化方法來計算每個組分的含量。

1.3.5 數據分析

對原始數據進行拼接(FLASH[13],version)，將拼接后的序列進行質量過濾(Trimmomatic[14],version),并去除嵌合體(UCHIME[15],version),得到高質量的Tags序列。對序列在相似性97%的水平上進行聚類(UCLUST[16],version 1.2.22)，以測序序列數的0.005%作為閾值過濾OTU[17]。通過使用Mothur方法，SILVA[18](Release119 http://www.arb-silva.de)和UNITE[19](Release 7.0 http://unite.ut.ee/index.php)的數據庫對物種進行注釋(閾值設定為0.8～1)，從而得到分類學信息并在各個水平上進行分類。Chao1、Simpson、Shannon、ACE指數用Qiime軟件來計算。此外對代謝產物進行分析，用Origin 8.5軟件處理。

2 結果與分析

2.1 樣品中序列數的特點

將提取好的樣品，合格后進行高通量測序。通過Illumina PE250測序，將所有樣品進行聚類，在97%的相似性下對樣品進行OTU聚類，然后對OTUs的代表序列進行物種注釋。

2.2 樣品中細菌多樣性分析

2.2.1 樣品細菌群體間多樣性分析

每個樣品的Chao1指數和Shannon指數可以用來評估物種豐度和多樣性(見表1)。

表1 酵子中細菌群落多樣性指數Table 1 Diversity indices of bacterial communities in Jiaozi

注：DL，WG分別代表陜西渭南市大荔縣，陜西咸陽市武功縣兩個地區(qū)的酵子。下同

陜西關中不同地區(qū)取得的酵子樣品測序深度均在99%以上，能夠較好地代表各地區(qū)酵子中細菌種群的真實情況。通過對比Ace指數,可以估計樣品中的樣品總數，大荔和武功地區(qū)樣品中Ace指數分別為17.25和47.79，表明武功地區(qū)酵子中微生物菌群豐度較高，可以估計樣品中微生物多樣性。大荔和武功地區(qū)樣品中Shannon指數分別為0.93和1.68，武功地區(qū)酵子樣品中細菌香農指數明顯高于大荔地區(qū)樣品，表明陜西關中大荔和武功兩個地區(qū)酵子中微生物群落差異性較大。

2.2.2 細菌群落各水平上的分布

本研究中，在所有酵子樣品門、綱、目、科、屬5個水平上，其中含量大于5%的細菌菌群見表2。結果顯示：在門水平上，Proteobacteria為大荔地區(qū)優(yōu)勢菌群門，含量為77.94%。

Firmicutes為武功地區(qū)優(yōu)勢菌群，含量為75.44%；在綱水平上，Alphaproteobacteria在大荔地區(qū)所占比例最高為77.89%。Bacilli在武功地區(qū)占到75.44%；在目水平上，Rhodospirillales為大荔地區(qū)優(yōu)勢菌群含量為77.66%。Lactobacillales在大荔和武功地區(qū)豐度分別為22.06%和74.99%。而Sphingomonadales為武功地區(qū)優(yōu)勢菌群，含量為22.16%；在科水平上，Acetobacteraceae和Lactobacillaceae為大荔地區(qū)優(yōu)勢菌群，分別占77.66%和22.06%。Sphingomonadaceae為武功地區(qū)優(yōu)勢菌群占22.16%，而Lactobacillaceae在大荔和武功地區(qū)樣品中含量分別為22.06% 和68.76% 有明顯差異；在屬水平上，Acetobacter為大荔地區(qū)酵子中的優(yōu)勢菌群屬，所占比例最高，為76.96%， 而在武功含量小于1%。Sphingomonas在武功地區(qū)所占比例較高為22.16%。Lactobacillus在大荔地區(qū)和武功的酵子中分別為22.06%和67.50%，為武功地區(qū)優(yōu)勢菌屬。

表2 酵子中的優(yōu)勢細菌群落在不同水平上的分布Table 2 The distribution of dominant bacteria communities in different levels of Jiaozi

注：“-”指豐度低于5%，或未檢測出的菌群。表中列出了豐度高于5%的細菌菌群。下同。

2.2.3 細菌群落屬水平上分布熱圖

根據OUT數據進行標準化處理(取對數)之后，選取數目最多的前24個物種，基于R-heatmap進行作圖，熱圖中不同色塊代表不同屬的豐度，橫向代表樣品，縱向代表物種，如圖1所示。在大荔地區(qū)的細菌群落中觀察到2個富集群，包括Acetobacter和Lactobacillus，但在武功地區(qū)中Acetobacter很少被鑒定出來。在武功地區(qū)，觀察到4個富集群，分別為Lactobacillus，Sphingomanas，Weissella和Pediococcus，但在大荔地區(qū)Sphingomanas，Weissella和Pediococcusk菌群屬很少。陜西關中大荔和武功地區(qū)含量較豐富的細菌菌群僅觀察到1個Lactobacillus菌屬。

2.3 樣品中真菌多樣性分析

2.3.1 樣品真菌群體間多樣性分析

大荔和武功地區(qū)樣品中Ace指數分別為26.21和114.24，表明武功地區(qū)酵子中微生物真菌菌群多樣性遠高于大荔地區(qū)。大荔和武功地區(qū)樣品中Shannon 指數分別為0.06和2.37，表明2個地區(qū)樣品中真群落結構差異較大。

表3 酵子中真菌群落多樣性指數Table 3 Diversity indices of fungi communities in Jiaozi

2.3.2 真菌群落各水平上的分析

本研究中含量大于5%的真菌菌群見表4。結果顯示：在門的水平上，Basidiomycota為大荔地區(qū)優(yōu)勢菌群占99.30%。 Ascomycota在武功地區(qū)豐度為97.39%； 在綱水平上，Tremellomycetes為大荔優(yōu)勢菌群綱占99.30%。

表4 酵子中的優(yōu)勢真菌群落在不同水平上的分布Table 4 The distribution of dominant fungi communities in different levels of Jiaozi

Sordariomycetes，Dothideomycetes和Eurotiomycetes為武功地區(qū)優(yōu)勢菌群，分別為41.20%，40.76%，12.35%； 在目水平上，Trichosporonales在大荔地區(qū)占到99.30%。Hypocreales和Pleosporales在武功地區(qū)豐度分別為35.17%和34.83%；在科水平上，Trichosporonaceae在大荔地區(qū)含量為99.30%。武功地區(qū)Pleosporaceae和Nectriaceae分別占34.53%和30.51%；在屬水平上，Trichosporon在大荔地區(qū)所占比例最高，為99.30%，而在武功地區(qū)中幾乎沒有。Alternaria和Nectriaceae_unclassified為武功地區(qū)中的優(yōu)勢菌群屬，分別為32.84%和24.26%。Gibberella，Sordariomycetes_unclassified在大荔地區(qū)含量均小于5%。

2.3.3 真菌群落屬水平上分布熱圖

大荔和武功地區(qū)酵子中真菌菌群聚類熱圖如圖2所示。

圖2 兩個地區(qū)酵子中前51個豐富屬的真菌分布熱圖Fig.2 Heatmap showing the fungi distribution of the top 51 abundant genera among the 2 regions of Jiaozi

在大荔地區(qū)的真菌群落中觀察到1個富集群，為Trichosporon。在武功地區(qū)的4個富集群為Alternaria，Gibberella，Nectriaceae和Sordariomycetes，但在大荔地區(qū)這些菌群屬都很少被鑒定出來。結果表明關中不同地區(qū)酵子中真菌菌群差異較大。

2.4 代謝物分析

代謝物：DL地區(qū)，2個肽、2個醛、5個嘌呤、1個嘧啶、14個酮、2個酚、2個維生素、3個堿、5個雜環(huán)類化合物，23個苷；WG地區(qū)，1個醛、1個嘌呤、1個嘧啶、9個酮、4個酚、1個堿、5個雜環(huán)類化合物、22個苷。

通過氣相色譜飛行時間質譜技術對陜西關中兩個不同地區(qū)的酵子發(fā)酵中代謝產物進行分析(見表5)。大荔和武功地區(qū)分別檢測出480和314種代謝物，結果表明主要的代謝產物是有機酸和氨基酸類物質。不同地區(qū)代謝產物相對種類和含量呈現出一定的差異。胺類和酰胺類在2個樣品中含量均較少。

表5 酵子中鑒定出的化學成分分類Table 5 Classification of chemical constituents identified in Jiaozi

對關中地區(qū)鑒定出的相對含量大于1%的代謝物質進行分析(見圖3)。

結合表5可以看出酸類和醇類是酵子中主要代謝物質，在大荔地區(qū)的酵子中酸類物質占到了34.12%，其中主要是反油酸(elaidic acid)，棕櫚酸(palmitic acid)，氧脯氨酸(oxoproline)；醇類物質占到了15.6%，主要是肌醇(myo-inositol)，核糖醇(ribitol)，2-脫氧赤蘚糖醇(2-deoxyerythritol)；糖類物質主要為葡萄糖(glucose)占1.46%，磷酸鹽(phosphate)為1.22%，羥胺類物質占到了1.03%。而在武功地區(qū)酸類物質主要為琥珀酸(succinic acid)，L-蘋果酸(L-malic acid)占到了15.44%；醇類物質主要為核糖醇(ribitol)，肌醇(myo-inositol)占到了18.91%；糖類物質主要為麥芽糖(maltose)和異麥芽糖(Isomaltose)占到了7.19%， 磷酸鹽為1.10%，羥胺類物質占到了2.66%。 大荔和武功地區(qū)相比，大荔地區(qū)酸類物質和核糖醇含量明顯高于武功地區(qū)，而武功地區(qū)醇類物質總量高于大荔地區(qū)大約3%，糖類物質也高于大荔地區(qū)，然而羥胺類物質和磷酸鹽含量變化較少。

3 討論

本文以陜西關中不同地區(qū)的酵子為研究對象，利用高通量測序技術對酵子中細菌及真菌菌群多樣性進行了研究，同時對2個樣品酵子中代謝產物進行了分析。目前國內外對于具有地域特色的酵子中真菌多樣性及代謝組學的研究較少。ZHANG等[6]對傳統(tǒng)面食發(fā)酵劑中微生物種類進行了研究，對酵子中細菌多樣性進行了分析，其結果顯示Leuconostoc，Lactobacillus 和Weissella為酵子中的優(yōu)勢菌群。本研究結果發(fā)現，Acetobacter和Lactobacillus為酵子中的優(yōu)勢菌群，與目前研究報道中其他地區(qū)酵子中優(yōu)勢菌群一致[20]，西北地區(qū)中優(yōu)勢菌群為Acetobacter[11]。本研究同時發(fā)現武功地區(qū)酵子中微生物菌群結構多樣性明顯比大荔地區(qū)復雜。在大荔地區(qū)Acetobacter為主要富集菌群，Lactobacillus和Weissella則僅在武功地區(qū)含量較為豐富，而Sphingomonas和Weissella這2種菌群在大荔地區(qū)沒有發(fā)現大的聚集。且武功地區(qū)乳酸菌含量高達67.50%，與研究表明酵子中的乳酸菌為優(yōu)勢菌株的結果保持一致[20]。武功地區(qū)乳酸菌為優(yōu)勢菌種，不但可以發(fā)酵產生各種有機酸，且與酵母菌發(fā)酵產生的醇類物質作用產生酯類，賦予食品獨特的風味，同時作為益生菌群，可以調節(jié)腸道菌群平衡，對人體健康存在有益影響。此外，大荔地區(qū)優(yōu)勢菌株醋酸桿菌代謝可以賦予酸面團特征風味成分，改善質構，抑制腐敗微生物等[21]。

對酵子中真菌多樣性進行分析，相關研究表明傳統(tǒng)面食發(fā)酵劑中以酵母菌為主[22]，對發(fā)酵食品風味，色澤，質地有著重要的作用。酵子中Saccharomyces-cerevisiae和Candida-krusei等20種酵母菌為優(yōu)勢菌種[7,23]。本研究中Trichosporon是大荔地區(qū)優(yōu)勢菌群，與其他研究中酵母菌為優(yōu)勢菌種的結論一致[24]，但種類有所差距。而Nectriaceae和Sordariomycetes在武功地區(qū)顯示出較高的豐度，試驗發(fā)現的高豐度菌群還包括Alternaria和Gibberella，表明傳統(tǒng)面食發(fā)酵劑中是酵母菌，乳酸菌，霉菌混和發(fā)酵體系[25-26]，除此之外結合細菌多樣性發(fā)現還含有醋酸桿菌在內的其他細菌，甚至可能含有致病菌[21]。Alternaria是一種黑曲霉菌，雖然不是酵子真菌中的常見菌種，但在商業(yè)中也有很重要的應用，發(fā)酵工業(yè)生產過程中用于生產各種蛋白酶，殼聚糖等[27]。結果顯示武功和大荔雖然都處于關中地帶但是各分類水平上群落組成差異性較大。

酵子中乳酸菌和酵母菌含量比為100∶1[28-29]。本研究表明武功地區(qū)乳酸菌含量高于大荔地區(qū)，而大荔地區(qū)酵母菌含量高于武功地區(qū)，大荔地區(qū)代謝產物種類高于武功地區(qū)。酵母菌可以利用葡萄糖，蔗糖等發(fā)酵糖類代謝產生CO2，使得面食制品獲得獨特的質構，并且代謝過程中會有利于發(fā)酵產品形成獨特的風味的其他產物[30-31]。醇類物質在武功和大荔地區(qū)含量差異不大，而大荔地區(qū)由于Acetobacter的大量存在，優(yōu)勢菌株醋酸桿菌代謝產生大量醋酸使得有機酸類物質含量較高[21]，武功地區(qū)由于乳酸桿菌含量高達67.50%，其發(fā)酵產生的有益酸類物質琥珀酸、蘋果酸等占據到了15.44%，有助于形成面包獨特的風味[20]。大荔地區(qū)Trichosporon含量高達99%以上，而在代謝產物中如圖4，可以看出葡萄糖含量明顯少于武功地區(qū)。乳酸菌在代謝過程中產生的氨基酸對發(fā)酵面食的風味起著重要作用[32]。且武功地區(qū)優(yōu)勢菌群Lactobacillus豐度遠大于武功地區(qū)，而乳酸菌在發(fā)酵過程中產生的氨基酸可以通過脫氨和轉氨代謝獲得各種風味或風味前體物質[32-33]，導致武功地區(qū)醛，酯類物質含量大于大荔地區(qū)。本研究得知武功地區(qū)有益成分遠高于大荔地區(qū)所檢測到的代謝產物含量，更有利于生產營養(yǎng)豐富的面食制品。

4 結論

本研究利用高通量測序技術和代謝產物分析來研究陜西關中地區(qū)酵子中真菌和細菌菌群結構多樣性，了解關中平原大荔和武功地區(qū)中微生物的種類和代謝產物。結果表明酵子中真菌較細菌相比種類更加多樣，Trichosporon為大荔地區(qū)優(yōu)勢真菌屬，Alternaria和Nectriaceae為武功地區(qū)優(yōu)勢真菌屬。Acetobacter和Lactobacillus為大荔地區(qū)優(yōu)勢細菌屬，武功地區(qū)優(yōu)勢細菌屬分別為Lactobacillus。關中不同地區(qū)的酵子在菌群結構和多樣性差別較大，具有較為明顯的區(qū)域性特色，結合代謝產物分析，武功地區(qū)酵子菌群較為豐富且代謝產物有益于生產面食，具有非常好的研究意義，為進一步開發(fā)質量安全，風味優(yōu)良的食品發(fā)酵劑奠定了基礎。