劉仁杰,梁珊,李哲,樸春紅

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春,130118)

芽孢桿菌是廣泛存在于植物中的一種內(nèi)生菌。內(nèi)生菌是指在整個(gè)生長(zhǎng)周期中一直存在于植物的根、莖、葉和花朵等部位[1]，不會(huì)對(duì)宿主植物表現(xiàn)出任何外部病癥甚至對(duì)植物本身有益的菌株[2]。芽孢桿菌為好氧或兼性厭氧菌，易產(chǎn)生內(nèi)生芽孢。芽孢壁厚而含水量低具有多層外壁，對(duì)光照、熱和輻射等都具有較強(qiáng)抵抗力[3]。芽孢桿菌菌體呈桿狀，大小為(0.3～2.2) μm×(2.1～7.0) μm，鞭毛典型側(cè)生，形成的內(nèi)生孢子為抗熱型[4]。芽孢桿菌屬的建立是根據(jù)形態(tài)特征，即經(jīng)典分類法確立，根據(jù)芽孢的形狀(卵型或球型)以及其在菌體或芽孢囊的位置，芽孢桿菌可分為3大類：群I，孢囊不顯著膨大，芽孢橢圓或柱形，中生到端生，革蘭氏陽(yáng)性；群II，橢圓形芽孢，孢囊膨大，芽孢中生到端生，革蘭氏陽(yáng)性、陰性或可變;群III，孢囊膨大;芽孢通常球形，端生到亞端生，革蘭氏陽(yáng)性、陰性或可變[5]。常見(jiàn)的芽孢桿菌有蠟樣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、梭狀芽孢桿菌和產(chǎn)氣芽孢桿菌等?？莶菅挎邨U菌與蠟樣芽孢桿菌存在于空氣、土壤中，極易于食品接觸。對(duì)于大豆作物而言，枯草芽孢桿菌是一種植物內(nèi)生菌，與食品的加工、生產(chǎn)及儲(chǔ)存過(guò)程密不可分，難以避免。而其他令我們聞而色變的芽孢桿菌如昆蟲(chóng)病原菌蘇云金桿菌(B.thuringiensis)，人畜病原菌炭疽芽孢桿菌(B.anthracis)、蕈狀芽孢桿菌(B.mycoides)、韋氏芽孢桿菌(B.weihenstephanensis)，也廣泛存在于外部環(huán)境中[6]。

芽孢桿菌可以產(chǎn)生內(nèi)孢子，對(duì)不利環(huán)境有較強(qiáng)抵抗力，可能在多種食品保質(zhì)期內(nèi)萌發(fā)，引起食品腐敗變質(zhì)和疾病的傳播。蠟樣芽孢桿菌在意外攝入量>103CFU/g時(shí)，1～6 h內(nèi)可以引起嘔吐、腹瀉；在8～16 h可在小腸內(nèi)形成熱不穩(wěn)定性腸毒素，導(dǎo)致嚴(yán)重腹痛及水樣腹瀉[7]。近幾年，蠟狀芽孢桿菌開(kāi)始作為益生素加入到食品和飼料中，作為一種有益微生物促進(jìn)植物生長(zhǎng)、防治病蟲(chóng)害[8]，但對(duì)這些菌株進(jìn)行安全性評(píng)價(jià)是非常必要的。產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌可以引起人和動(dòng)物組織毒性和胃腸道疾病，起病急、病程發(fā)展迅速，作用于空腸及回腸，以腹痛、腹瀉、腹脹、便血、嘔吐、發(fā)熱為主要中毒癥狀[9],這與金黃色葡萄球菌中毒癥狀相似，不利于病癥的診治[10]，引起腸道病理性病變及壞死[11-12]，嚴(yán)重時(shí)會(huì)導(dǎo)致消費(fèi)者急性中毒死亡[13]，且常規(guī)抑菌劑如乳酸鏈球菌素、山梨酸鹽、苯甲酸及殼聚糖等抑制作用不明顯?？莶菅挎邨U菌雖然不會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生嚴(yán)重的毒害作用，但是其迅速繁殖會(huì)產(chǎn)生感官上的不良感受。

芽孢可以存活于經(jīng)過(guò)巴氏殺菌的嬰兒配方乳粉中，在經(jīng)過(guò)沖泡后，室溫條件下放置8 h，即可以產(chǎn)生105CFU/g的病原菌，嚴(yán)重危害嬰幼兒的健康，降低嬰幼兒食品安全性[14]。中溫好氧芽孢桿菌廣泛存在于原料奶中，在經(jīng)過(guò)超高壓瞬時(shí)殺菌后仍然可以在牛奶中生長(zhǎng)萌發(fā)，菌落數(shù)可較快達(dá)到105CFU/mL，嚴(yán)重影響奶制品的品質(zhì)并縮短其貨架期，成為奶制品行業(yè)的一大難題[15]。在乳品工業(yè)中，發(fā)現(xiàn)一些耐低溫的蠟狀芽孢桿菌和韋氏芽孢桿菌，在6 ℃甚至是更低的條件下繁殖，并產(chǎn)生腸毒素引起食物中毒[16]。芽孢可在一切適宜條件下生長(zhǎng)，并快速繁殖，嚴(yán)重影響食品安全。目前芽孢桿菌被許多國(guó)家認(rèn)定為一種最常檢出的微生物，成為食品檢測(cè)的必檢項(xiàng)目。本文就芽孢桿菌的殺滅方法和殺滅機(jī)理進(jìn)行綜述。

1 芽孢桿菌的殺菌方法研究進(jìn)展

1.1 熱殺菌法

熱殺菌法主要包括巴氏殺菌法、超高溫瞬時(shí)殺菌和高壓滅菌法等。熱殺菌技術(shù)在食品工業(yè)中應(yīng)用廣泛，熱殺菌的本質(zhì)是用燃料或電阻加熱在食品外部加以熱能，將熱能轉(zhuǎn)移到食品內(nèi)部，從而達(dá)到殺菌和鈍化酶的目的[17]。但熱殺菌過(guò)程中高溫會(huì)導(dǎo)致食品色澤、風(fēng)味的改變和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的損失。對(duì)于芽孢桿菌來(lái)說(shuō)，孢外壁、芽孢衣和皮層共同組成的細(xì)胞外壁厚且結(jié)構(gòu)豐富，常規(guī)熱傳遞難以作用于核心部位，達(dá)不到有效殺滅的目的[18]，常與其他殺菌方法混合使用增強(qiáng)殺菌效果。高溫殺菌會(huì)使食品的口感、色、香、味以及營(yíng)養(yǎng)成分發(fā)生嚴(yán)重劣變，降低商業(yè)價(jià)值。對(duì)于熱能的消耗也嚴(yán)重增加了產(chǎn)品的生產(chǎn)成本，因此熱殺菌法越來(lái)越不受消費(fèi)者和生產(chǎn)者的歡迎。

1.2 高壓殺菌法

高壓殺菌法有高靜壓法和高壓脈沖電場(chǎng)法。高靜壓殺菌技術(shù)是將100～1 000 MPa的靜態(tài)液體壓力施加于食品上并保持幾秒鐘到幾十分鐘，起到殺菌、破壞酶及改善物料結(jié)構(gòu)和特性的作用[19]。黃訓(xùn)端等[20]發(fā)現(xiàn)蠟樣芽孢桿菌(1010CFU/mL)在室溫下施壓15 min，壓力越大對(duì)芽孢桿菌的損傷程度越大，死亡率越高。脈沖電場(chǎng)殺菌技術(shù)是將高電壓(15～100 kV/cm)脈沖作用于電極間的食品，常溫下進(jìn)行，作用時(shí)間極短，一般<1 s。高壓殺菌技術(shù)對(duì)于一些對(duì)壓力抵抗力較弱的芽孢桿菌極富效果，對(duì)某些頑強(qiáng)的芽孢需要更大壓力。超高壓設(shè)備體積大而昂貴，小型生產(chǎn)企業(yè)難以應(yīng)用，導(dǎo)致超高壓殺菌法無(wú)法廣泛應(yīng)用。

1.3 氣體殺菌法

氣體殺菌法主要包括臭氧殺菌法和二氧化氯殺菌法等。臭氧具有廣譜抗菌特性，對(duì)細(xì)菌營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞、芽孢、病毒、真菌均有高效殺滅作用。2001年FDA將臭氧列入可直接與食品接觸的添加劑范圍[21]。耿淑潔等[22]發(fā)現(xiàn)臭氧對(duì)枯草芽孢桿菌芽孢有較強(qiáng)的滅活作用。在pH為8.16、水溫為(20±1)℃條件下，7個(gè)對(duì)數(shù)級(jí)芽孢經(jīng)臭氧作用5 min后，失活4.68個(gè)對(duì)數(shù)級(jí)，可控制絕大多數(shù)芽孢桿菌的活性，但對(duì)于生長(zhǎng)繁殖極其迅速的芽孢桿菌來(lái)說(shuō)，殺滅不徹底就意味著芽孢桿菌仍對(duì)食品存在巨大威脅。2013年白小龍[23]發(fā)現(xiàn)在二氧化氯氣體質(zhì)量濃度為100 mg/L、殺菌40 min，二氧化氯氣體對(duì)苦蕎表面的枯草芽孢桿菌具有良好殺滅效果。但氣體殺菌法對(duì)于結(jié)構(gòu)致密的物質(zhì)而言，難以達(dá)到其內(nèi)部，僅能殺滅物質(zhì)表面的芽孢桿菌，不能對(duì)內(nèi)部芽孢桿菌進(jìn)行良好的抑制。

1.4 化學(xué)滅菌法

化學(xué)滅菌法包括添加抑菌劑和添加消毒劑。常用的抑菌劑包括山梨酸鉀、苯甲酸鈉、表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯、乳酸鈉、乳酸鏈球菌素等。AOUADHI等發(fā)現(xiàn)山梨酸鉀和乳酸鏈球菌素聯(lián)合作用，在24 h內(nèi)可以緩慢抑制LTIS27型芽孢桿菌的萌發(fā)和生長(zhǎng)，在5 d后可以達(dá)到完全抑制的作用?，F(xiàn)階段人們更加趨向于對(duì)天然抑菌劑的研究,如丁香酚[24]、肉桂醛[25]、大蒜素[26]和魚(yú)腥草[27]等物質(zhì)，雖然這些物質(zhì)可以對(duì)芽孢桿菌起到一定抑制作用，但不能完全抑制或者及時(shí)殺滅。還有其他化學(xué)物質(zhì)如乙醇、乙酸等，這些物質(zhì)的添加會(huì)導(dǎo)致食品色澤風(fēng)味的改變，令消費(fèi)者難以接受，且作用效果不顯著?，F(xiàn)今對(duì)于食品安全的重視導(dǎo)致化學(xué)物質(zhì)的加入,增加了消費(fèi)者購(gòu)買的心理顧慮，越來(lái)越多的人拒絕添加劑的濫用。

1.5 促萌發(fā)法

由于芽孢桿菌的特殊生理結(jié)構(gòu)，常規(guī)有害微生物的防治方法并不適用于芽孢桿菌的滅活，技術(shù)上存在一定的壁壘，消費(fèi)者心理也難以承受。近年來(lái)對(duì)于促萌發(fā)法的研究引起了人們的廣泛關(guān)注，其優(yōu)點(diǎn)在于添加的物質(zhì)成分簡(jiǎn)單易于接受，作用較為迅速。孢子的萌發(fā)是芽孢桿菌生長(zhǎng)繁殖的第一步，此時(shí)萌發(fā)形成的營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞對(duì)于外界環(huán)境失去抗性，簡(jiǎn)單方法即可完全殺滅。

這種方法主要分為兩種方式，一種采用營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)如葡萄糖、果糖、L-丙氨酸和D-丙氨酸等，另一種是用非營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)如Ca+-DPA和十二烷烴等誘導(dǎo)內(nèi)生芽孢萌發(fā)，產(chǎn)生營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞用較低溫度(65 ℃, 30 min)即可將芽孢桿菌殺滅的方法。TEHRI等[28]用糖類和氨基酸對(duì)巨大芽孢桿菌MTCC2949誘導(dǎo)萌發(fā)，用吸光度、熒光染色和酯酶測(cè)定萌發(fā)效果，發(fā)現(xiàn)L-丙氨酸可以有效誘導(dǎo)芽孢桿菌孢子萌發(fā)。AOUADHI等[29]在2013年將D-葡萄糖(1 mmol/L)和L-丙氨酸(100 mmol/L)混合使得LTIS27芽孢桿菌萌發(fā)89%。通過(guò)對(duì)于不同種類以及不同基因型芽孢桿菌的研究發(fā)現(xiàn)：不同芽孢桿菌需要不同的促萌發(fā)劑，篩選出一種廣譜高效的促萌發(fā)劑至關(guān)重要。不同促萌發(fā)劑的混合使用可以增加芽孢桿菌的萌發(fā)率，目前對(duì)于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)混合添加是增加促萌發(fā)率行之有效的辦法之一。

2 芽孢桿菌的殺菌機(jī)理研究進(jìn)展

2.1 核蛋白以及酶對(duì)芽孢桿菌的影響

常規(guī)熱殺菌的殺菌機(jī)理就是通過(guò)熱傳遞與熱傳導(dǎo)將熱能轉(zhuǎn)移到芽孢內(nèi)層核心部位，使芽孢質(zhì)和芽孢核中的酶等蛋白變質(zhì)，蛋白質(zhì)的變質(zhì)會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞無(wú)法增殖分化，從基因?qū)用嬉约吧L(zhǎng)環(huán)境方面抑制芽孢桿菌的活性，達(dá)到滅活的目的。

高壓殺菌法的殺菌機(jī)理是使芽孢桿菌中的氫鍵、離子鍵和疏水鍵等非共價(jià)鍵發(fā)生改變，破壞蛋白質(zhì)和酶的穩(wěn)定性，從而殺滅芽孢桿菌。HO等[30]用高壓脈沖電場(chǎng)(HPEF)處理水溶液中幾種酶，發(fā)現(xiàn)HPEF對(duì)葡萄糖氧化酶，脂肪酶，α-淀粉酶鈍化率都達(dá)到了75%以上，而α-淀粉酶鈍化率更是達(dá)到了85%。過(guò)氧化物酶鈍化率30%，多酚氧化酶鈍化率40%，堿性磷酸酶的鈍化率只有5%?？梢园l(fā)現(xiàn)高壓也是作用于細(xì)胞的酶，達(dá)到殺菌的作用。100～200 MPa下可以使芽孢桿菌的受體蛋白被激活，而更高壓力(500～600 MPa)下可以導(dǎo)致Ca2+-DPA通道打開(kāi)，引起孢子的萌發(fā)。

臭氧殺菌作用機(jī)理是先作用于細(xì)胞膜，使膜構(gòu)成成分受損傷而導(dǎo)致新陳代謝障礙，臭氧繼續(xù)滲透穿過(guò)膜而破壞膜內(nèi)脂蛋白和脂多糖，改變細(xì)胞的通透性，導(dǎo)致細(xì)胞溶解、死亡；同時(shí)臭氧還能使細(xì)胞活動(dòng)所必要的酶失去活性，而影響其正常的生理功能。臭氧作用方式有兩種：I.臭氧溶于水直接反應(yīng)；II.臭氧分解生成的羥基間接反應(yīng)。一般情況下由兩種方式同時(shí)發(fā)揮作用，作用效果更強(qiáng)[31]。CO2與高壓同時(shí)作用使芽孢桿菌機(jī)械性損傷，導(dǎo)致細(xì)胞核內(nèi)容物外泄，嚴(yán)重破壞其生理結(jié)構(gòu)[32]。

霍健聰?shù)萚33]將魚(yú)腥草提取物作用于枯草芽孢桿菌的細(xì)胞壁，造成細(xì)胞壁破裂，內(nèi)容物泄漏，最終導(dǎo)致菌體崩解、死亡。與丁香酚、檸檬醛等作用機(jī)制相似，都是作用于芽孢桿菌細(xì)胞壁，最終發(fā)揮抑菌效果。王曉英[34]發(fā)現(xiàn)蒲公英總黃酮類提取物可以妨礙芽孢桿菌蛋白質(zhì)的正常表達(dá)，導(dǎo)致芽孢桿菌正常生理功能喪失，起到抑菌作用。王濤[35]在2011年發(fā)現(xiàn)嗜熱脂肪芽孢桿菌通過(guò)抑制劑的作用可導(dǎo)致細(xì)胞耐熱性明顯降低，進(jìn)而破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，引起細(xì)胞凋亡。

2.2 膜受體以及通道對(duì)于芽孢桿菌的影響

促萌發(fā)方法的殺菌機(jī)理：營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)誘導(dǎo)的萌發(fā)是由于芽孢桿菌表面的營(yíng)養(yǎng)受體引起的，研究表明只有外界化學(xué)物質(zhì)與其特定的受體蛋白結(jié)合，才能傳導(dǎo)萌發(fā)信號(hào)?，F(xiàn)發(fā)現(xiàn)營(yíng)養(yǎng)受體上有3種操縱子gerA、gerB和gerK，gerA操縱子是芽孢桿菌孢子萌發(fā)的主要操縱子[36-37]，gerA上含有g(shù)erAA、gerAB和gerAC三種同源編碼蛋白[38]。萌發(fā)的孢子中至少含有其中一種操縱子才能行使萌發(fā)功能。萌發(fā)劑與受體之間并不是一一對(duì)應(yīng)的關(guān)系，有時(shí)一種促萌劑需要多種受體同時(shí)發(fā)揮作用，如gerA是L-丙氨酸的受體蛋白[39]，gerB和gerK是葡萄糖的萌發(fā)受體[40]。營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)對(duì)不同基因型的芽孢桿菌是否起萌發(fā)作用也要?dú)w因于萌發(fā)受體的識(shí)別作用。這些操縱子向核蛋白傳遞信號(hào)，啟動(dòng)萌發(fā)程序，在十幾分鐘甚至幾分鐘就可以完成萌發(fā)指令。另外有研究表明營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)入芽孢桿菌的內(nèi)部過(guò)程需要經(jīng)過(guò)孢子衣與皮層，而芽孢桿菌中的另一種蛋白gerP是參與編碼芽孢桿菌外壁的主要蛋白，對(duì)芽孢桿菌的殺滅同樣起重要作用[41]。

非營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)誘導(dǎo)的萌發(fā)可能是由于離子通道受阻引起的，其中離子通道主要包括：鉀離子通道、鈣離子通道、鈉離子通道等。不同物質(zhì)抑制芽孢桿菌孢子萌發(fā)的離子通道是不同的[42]。芽孢桿菌萌發(fā)會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞透過(guò)性增強(qiáng)，導(dǎo)致細(xì)胞核中的氫離子、鉀離子和鈉離子外泄，同時(shí)伴隨著鈣離子的釋放。JOHNSON[43]發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌中YlaJ和YhcN蛋白的缺失會(huì)降低孢子的萌發(fā)速率，可能是YlaJ和YhcN蛋白參與編碼SleB和cwlJ皮質(zhì)水解酶，其中SleB皮質(zhì)水解酶發(fā)揮主要作用。皮質(zhì)水解酶會(huì)分解芽孢壁，導(dǎo)致芽孢萌發(fā)速率的改變。在蠟樣芽孢桿菌中發(fā)現(xiàn)一種受體蛋白gerN，與次黃嘌呤核苷酸誘導(dǎo)的萌發(fā)密切相關(guān)[44]。次黃嘌呤核苷酸對(duì)于離子變化極其敏感，因此推斷gerN可能參與編碼細(xì)胞內(nèi)的離子通道。

兩種殺菌機(jī)理相輔相成，細(xì)胞膜的皮質(zhì)水解酶中的肽聚糖受損，易導(dǎo)致外來(lái)物質(zhì)(營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)以及非營(yíng)養(yǎng)物質(zhì))的進(jìn)入，同時(shí)也導(dǎo)致細(xì)胞核內(nèi)的陽(yáng)離子外流，增加了細(xì)胞膜的流動(dòng)性，影響離子通道的開(kāi)放。微觀層面上是由于細(xì)胞膜表面上的蛋白受體，受操縱子的影響反作用于細(xì)胞核刺激釋放出萌發(fā)信號(hào)。同時(shí)細(xì)胞中的胞內(nèi)酶與胞外酶受蛋白質(zhì)的影響，溶解芽孢桿菌外層堅(jiān)韌結(jié)構(gòu)，使芽孢桿菌對(duì)外界環(huán)境抗性降低，最終引起細(xì)胞的滅活。

3 結(jié)論與展望

隨著人民生活水平的提高，消費(fèi)者對(duì)于食品安全格外看重。芽孢桿菌不易被完全殺滅，在食品中萌發(fā)會(huì)降低食品保質(zhì)期，危害消費(fèi)者健康。因此對(duì)芽孢桿菌殺滅技術(shù)的研究是不可或缺的，有效地保證食品安全，提高人民對(duì)于芽孢桿菌的重視至關(guān)重要。目前對(duì)于芽孢桿菌的殺滅仍存在如下問(wèn)題：(1)芽孢的多層結(jié)構(gòu)在整個(gè)生長(zhǎng)周期中，分別起到何種作用以及作用機(jī)理尚不明確。(2)目前對(duì)于芽孢桿菌的研究逐年增多，但僅限于對(duì)單種芽孢桿菌的殺滅研究，實(shí)際生產(chǎn)中常出現(xiàn)兩種甚至多種芽孢桿菌同時(shí)存在的情況，多種芽孢桿菌間的協(xié)同或拮抗作用對(duì)于芽孢桿菌殺滅的影響尚未明確。(3)添加有益菌防治有害菌仍是目前許多致病菌的有效防治手段，但篩選對(duì)芽孢桿菌有殺滅作用的益生菌的研究寥寥無(wú)幾，對(duì)于其中有效成分的提取及分析更是未見(jiàn)涉及。(4)近幾年，一些芽孢桿菌開(kāi)始作為益生素加入到食品和飼料中，作為有益微生物促進(jìn)植物生長(zhǎng)、防治病蟲(chóng)害。但對(duì)于這些菌株的安全性評(píng)價(jià)尚未作出明確的認(rèn)定。

芽孢桿菌的防控已經(jīng)越來(lái)越受廣大研究者的重視，目前研究主要針對(duì)芽孢桿菌的殺滅方法，對(duì)于芽孢桿菌的殺滅機(jī)理的研究仍然缺乏，應(yīng)該加大這方面的研究力度。探索不同基因型芽孢桿菌之間的共性，可為有效殺滅芽孢桿菌提供理論依據(jù)。同時(shí)，應(yīng)考慮消費(fèi)者對(duì)添加物的接受度，對(duì)其安全性和有效性進(jìn)行系統(tǒng)的研究。還可以將抑菌劑與萌發(fā)劑進(jìn)行整合，開(kāi)發(fā)復(fù)合防控手段，為食品生產(chǎn)企業(yè)提供高效的技術(shù)支撐。