任衍鋼 白冠軍 宋玉奇 路彥文

（陽泉師范高等?？茖W校 山西平定 045200）

早在1890年，德國科學家奧爾特曼（Altmann R.）觀察并首次提出線粒體是真核生物的細胞器，猜測線粒體具有遺傳自主性［1］。20世紀50年代，線粒體被確定具有細胞質遺傳特性；60年代，線粒體DNA 分子（mtDNA）被發(fā)現(xiàn)；70年代及80年代初，科學家逐漸開始了對線粒體基因組的研究；90年代至今，基因組的研究成果被不斷地應用于病理、系統(tǒng)發(fā)育等方面，成為生物學和醫(yī)學中的重要研究領域之一。本文著重從線粒體遺傳現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)、線粒體DNA 的發(fā)現(xiàn)和線粒體基因組的揭示3 個方面進行歷史簡述。

1 線粒體遺傳的發(fā)現(xiàn)

線粒體遺傳屬于非孟德爾遺傳。自從1909年柯倫斯（Correns C.）和鮑爾（Baur E.）各自獨立地發(fā)現(xiàn)了葉綠體的非孟德爾遺傳現(xiàn)象后，線粒體的遺傳就受到了關注。由于線粒體小于質體，故其研究難度大于質體。1934年，戈爾德施密特（Goldschmidt C.）［2］根據(jù)其研究成果推測，吉普賽蛾的顏色差異的原因可能與線粒體有關。1940年，“酵母遺傳之父”的丹麥科學家溫厄（Winge O.）和勞斯特森（Laustsen O.）［3］推測，近親繁殖二倍體酵母退化的現(xiàn)象與線粒體遺傳有關。用酵母菌研究線粒體的優(yōu)勢在于，酵母菌是單細胞真核生物，生命周期短，適合經(jīng)典遺傳學分析，且能在基本培養(yǎng)基上培養(yǎng)。除此之外，酵母菌的線粒體雖然一般比植物細胞的小，但一般要比動物細胞的大，數(shù)量比動物細胞的少，易用顯微鏡進行觀察。1949年，埃弗呂西（Ephrussi B.）［4］發(fā)現(xiàn)一種由突變導致的厭氧型小群落酵母的遺傳與細胞質有關，而不是與細胞核有關；不久，斯洛尼姆斯基（Slonimski P.）和埃弗呂西［5］進一步證實，這種突變與線粒體有關。1950年，我國科學家陳士怡［6］（1912—1994）在其導師埃弗呂西指導下首次發(fā)現(xiàn)，酵母菌中存在細胞質基因。1950—1952年，米切爾（Mitchell M.B.）等也發(fā)現(xiàn)粗糙脈孢菌線粒體的形成不符合孟德爾遺傳規(guī)律，這種生長緩慢型粗糙脈孢菌的遺傳與線粒體有關。需要指出的是，在20世紀50年代之前，盡管人們發(fā)現(xiàn)了線粒體的遺傳與細胞核無關，但是由于學者［例如，哈維（Harvey E.）用海膽卵和佐林格（Zollinger H.）用小鼠腎小管等］用實驗證明這些細胞在線粒體被除去或破壞后，可以再生線粒體，故人們普遍認為線粒體是通過細胞其他結構的改變而產生的。甚至60年代初，仍有人用實驗推斷線粒體來自核外的其他膜系統(tǒng)［7］?？梢?，線粒體內存在基因的事實并沒有因為發(fā)現(xiàn)線粒體屬于細胞質遺傳而被普遍認可。

2 線粒體DNA 的發(fā)現(xiàn)

隨著電子顯微鏡的使用和分子生物學的誕生，線粒體的相關研究取得了重要的進展。1952年，高分辨率的電子顯微鏡的使用，取代了詹納斯綠染色，作為顯示線粒體的首選方式。分子生物學的一系列發(fā)現(xiàn)促進了科學家尋找線粒體基因的存在。最初，曾有科學家依據(jù)酵母菌線粒體細胞質遺傳的特點和50年代關于質粒的研究成果，提出了類似病毒寄生宿主細胞的“侵入”假說，還依據(jù)草履蟲遺傳的研究成果提出了類似草履蟲遺傳的假說，甚至依據(jù)發(fā)現(xiàn)一些病毒中的遺傳物質是RNA而不是DNA，曾猜想線粒體內也含有像病毒RNA那樣的遺傳物質。為了證實這些假設，科學家開展了一些實驗，但都無果而終［8］。20世紀50年代和60年代初，雖然沒有找到在酵母菌中存在DNA的直接證據(jù)，但在動物的線粒體中卻找到了。1956—1957年間，切夫雷蒙特（Chevremont J.）及其同事在用脫氧核糖核酸酶（DNase）處理成纖維細胞線粒體時發(fā)現(xiàn)，線粒體內的某種物質會發(fā)生陽性反應，由此猜想線粒體內有DNA 存在，但這是在特殊條件下才得到的孚爾根陽性反應，不能令人信服。1963年，在瑞典大學實驗生物學研究所工作的M·納斯（Nass M.）和S·納斯（Nass S.）［9］通過線粒體內纖維固定和電子染色反應的方法，用電子顯微鏡觀察到在小雞胚胎細胞線粒體中存在具有DNA 特性的絲狀纖維，這些絲狀纖維類似于細菌、藍藻的核質。他們的發(fā)現(xiàn)引起了科學界的關注，被認為是首次證實線粒體中存在DNA 分子。盡管如此，酵母菌仍然是研究線粒體DNA 的重要生物。1962年，四柳（Yotsuyanagi Y.）［8］用電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，酵母菌中一些涉及到呼吸變異的類型主要與線粒體有關，與它們是否處于有氧或無氧的環(huán)境無關。他用電子顯微鏡觀察到，一些進行無氧呼吸的較小的酵母菌，其線粒體內膜缺乏像野生酵母菌那樣的“脊”，這無疑就將線粒體結構改變與呼吸能力聯(lián)系在一起。1964年，沙茨（G.Schatz）等用氯化銫密度梯度離心法發(fā)現(xiàn)，酵母菌線粒體的核酸存在于DNA 衛(wèi)星帶中（這是因為酵母菌線粒體中在堿基組成上比染色體具有更豐富的A、T 堿基），再次證實了線粒體DNA（mtDNA）的存在。既然線粒體中存在DNA 分子，下一步就是探討mtDNA 分子是否含有基因的問題了。1966年，芒諾盧（Mounolou J.）［10］等通過線粒體浮力密度的特殊變化，鑒定了符合非孟德爾遺傳的酵母菌的一個呼吸缺陷突變是由mtDNA的改變引起的。他們選取了均具有mtDNA 分子的野生型（大型）酵母和突變的小型酵母，先鑒定了單倍體的小型酵母的mtDNA 分子與大型的mtDNA分子在堿基組成上存在差異；然后通過野生型與突變型雜交形成二倍體酵母菌，再通過減數(shù)分裂分離成單倍體酵母，證實了大型和小型的差異與其呼吸能力直接相關。緊接著，1967年，昆澤爾（Kuntzel H.）和諾爾（Noll H.）從脈孢菌線粒體中發(fā)現(xiàn)了類似于細菌的核糖體［也有報道說是線粒體核糖體是由奧布賴恩（O′ Brien T.W.）和卡爾夫（Kalf G.F.）在研究小鼠肝細胞中發(fā)現(xiàn)的［11］］。正是這些發(fā)現(xiàn)推動了美國生物學家馬古利斯（Margulis L.）于1967年重新提出更有說服力的線粒體起源的內共生學說。1969年，2 個實驗室都獨立地發(fā)現(xiàn)，用環(huán)己酰亞胺阻斷粗糙脈孢霉菌線粒體和酵母菌線粒體外的核糖體后，應用脈沖標記方法發(fā)現(xiàn)了線粒體能制造蛋白質［7］。補充說明，環(huán)己酰亞胺抑制細胞質基質中蛋白質的合成，但不抑制線粒體中蛋白質的合成。需要指出的是，雖然在20世紀60年代初中期，線粒體中DNA 的存在被證實并獲得了廣泛認可，但mtDNA 是否有自己的遺傳信息表達和蛋白質合成體系，還不能被完全確信，因為以前有人報道過在電子顯微鏡下找不到線粒體的現(xiàn)象。據(jù)此還有人認為，mtDNA 可能會像噬菌體一樣能整合到細胞核DNA 中。直至20世紀60年代末，科學家才證實，過去認為的線粒體丟失，只是由于用常規(guī)的電子顯微鏡難以檢測到而已。到20世紀70年代，通過對酵母菌mtDNA 突變的研究才解決了過去認為mRNA 是從細胞核導入的問題［7］。

3 線粒體基因組的揭示與應用

隨著線粒體DNA 被學術界所公認，1968年，托馬斯（Thomas D.Y.）和威爾基（Wilkie D.）等很快就用經(jīng)典遺傳學的方法繪制了酵母菌線粒體基因圖。1969年，“線粒體遺傳學”正式在澳大利亞的堪培拉召開的會議上確立。1975年，莫洛伊（Molloy P.L.）等發(fā)表了酵母線粒體基因組序列圖：“線粒體生物合成的抗生素抗性標記基因在酵母菌較小的突變體缺失分析”。這個序列雖然是一個粗的酵母mtDNA 基因組草圖，但意味著揭開了研究線粒體基因組的序幕［12］。從1974—1976年，一些實驗室開始使用限制性內切酶在特定的地方剪切DNA，這種方法的使用導致酵母和其他一些物種包括人類（智人）的mtDNA 圖譜得以開啟。1976年，斯里普拉卡什（Sriprakash K.）等［13］首先用這種方法完成了酵母mtDNA 的遺傳和物理圖譜。1977年，道格拉斯（Douglas M.）和布托（Butow A.）等發(fā)現(xiàn)一些多肽是由mtDNA 翻譯的。1978年，鮑思（Bos J.L.）和斯洛尼姆斯基（Slonimski P.）發(fā)現(xiàn)，一些線粒體基因是“中斷的”（不連續(xù)）的。1979年，馬卡奇尼（Maccecchini M.L.）和紐珀特（Neupert W.）等對大量的細胞質合成的線粒體蛋白質的前體進行了鑒定。到70年代末，線粒體基因組的基礎工作已基本完成。

20世紀80年代是人類線粒體基因組研究領域取得重大突破的時代。1981年，劍橋大學的亨森（Hensgens）小組在英國《自然》雜志上公布了人類線粒體基因核苷酸的完整序列和密碼子的特征，這個序列被稱之為“劍橋序列”（CRS）。這個序列共有16 569 個堿基對（bp），除了同啟動DNA 有關的D 環(huán)區(qū)（D-loop）外，只有87 個bp 不參與基因的組成?，F(xiàn)在使用的人類mtDNA 序列是它的修訂版（rCRS）。1987—1988年又是人類線粒體研究作出重大突破的2年，這2年發(fā)生了2 個引起學術界關注的事件。一是1987年，華萊士（Wallace D.）首先提出mtDNA 可能引起人類疾病，這被認為開辟了醫(yī)學遺傳學研究的新領域。次年（1988年），他又最先發(fā)現(xiàn)mtDNA 第11 778 位點的G—A 使NADH 脫氫酶亞單位（ND4）的蛋白質中第340 個氨基酸由精氨酸變成組氨酸。致盲率50%的Leber氏遺傳性視神經(jīng)病變（LHON）就是由該位點引起的。他被公認為是首次發(fā)現(xiàn)了人類mtDNA 缺失和點突變的學者，當然也是首次對線粒體疾病進行分子鑒定的科學家，他還在研究LHON 的基礎上提出了線粒體病的概念［14］。此后對線粒體缺陷引起的疾病的研究如雨后春筍般地爆發(fā)。到2016年，至少有275 種線粒體疾病被鑒定［15］。二是以威爾遜（Wilson A.）為首的美國加州大學伯克利研究組根據(jù)對祖先來自非洲、歐洲、亞洲及新幾內亞和澳大利亞土著共147 名婦女胎盤細胞mtDNA的分析，提出了生活在地球上的現(xiàn)代人類的共同祖先是大約15 萬年前生活在非洲的一個婦女。這就是學術上有較大爭論，后來被稱之為“線粒體夏娃”的假說。與核遺傳比較，線粒體基因組具有進化快、豐度高，遺傳模式簡單和具有保守緊湊的結構特點（例如細胞色素C 氧化酶I 亞基COI基因），這對研究生物的進化具有重要的意義。由于mtDNA 對人類的重要性，研究人員將線粒體基因組稱之為人類的第25 號染色體（人類基因組的結構：22+X+Y+mtDNA）。

進入20世紀90年代后，線粒體基因組測序工作全面展開。1996年第1 個真核生物——釀酒酵母的核基因組的完全測序得以完成，2年以后又確定了酵母菌線粒體基因組的完全測序［16］。1996年，科學家在美國加利福尼亞州圣克拉拉埃菲邁克斯公司的協(xié)助下，研發(fā)出首個線粒體微觀測序儀。這個儀器有大約25 美分硬幣大小的硅芯片，通過退火印刷處理，存儲了高達135 000 種DNA 序列片段，其全面性包括了大多數(shù)單螺旋mtDNA。同年，在田納西州的韋爾（Ware P.）案中，mtDNA 首次被作為破案的證據(jù)，應用mtDNA 分析指正韋爾犯有強奸和殺人罪。1997年第1 個植物——擬南芥的線粒體基因組的測序得以完成［17］。

進入新世紀后，mtDNA 在疾病的診治與防治、法醫(yī)學鑒定、遺傳學及系統(tǒng)發(fā)育學等方面的應用更加顯著。在家譜分析方面，2009年，專家應用mtDNA 分析對沙皇尼古拉二世進行了遺體的確認并破解了他的小女兒阿納斯塔西婭去向之迷（讀者可閱讀這方面的有關資料）。2013年，英國查理三世國王的遺體也是通過比對他的mtDNA與他妹妹2 個母系后代進行鑒定的。2016年，一種被稱作線粒體捐贈或線粒體替代療法（MRT）的體外受精技術首次應用，它通過從供體母細胞產生mtDNA，并從母本和父本的細胞核DNA 中產生后代。在紡錘體轉移過程中，一個卵子的細胞核被插入至一個已除去細胞核的卵子的細胞質中，但仍含有供體女性的mtDNA，然后使新卵子與精子受精。該程序能使線粒體基因有缺陷的母親生育一個線粒體健康的后代。墨西哥的一對夫婦用這種技術生了一個男孩。截止到2015年，有人統(tǒng)計Mitochondrial DNA雜志上收錄的文章中相關報道可達上千篇，眾多生物的線粒體基因組圖譜已經(jīng)被繪制［18］。

綜上所述，線粒體基因的發(fā)現(xiàn)和揭示經(jīng)歷了線粒體遺傳現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)、線粒體DNA 的發(fā)現(xiàn)和線粒體基因組的揭示與應用的過程。從中可以看到，對線粒體基因的認識并不是一蹴而就的，而是經(jīng)過了一個反復質疑和論證的過程。在對線粒體遺傳的認識中，模式生物酵母菌扮演了至關重要的角色。人類線粒體基因組的揭示為人類診斷、診治線粒體疾病，探討人類進化及法醫(yī)鑒定等方面開拓了廣泛領域，但是其開發(fā)和利用還遠遠不夠，尤其是對一些線粒體疾病的發(fā)現(xiàn)和診治仍具有更廣泛的前景。