張俊莉,趙雪微,賈晶,雙少敏

(山西大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院,山西 太原 030006)

0 引言

碳點(diǎn)作為一種新型的超小碳納米顆粒,與傳統(tǒng)的量子點(diǎn)[1]相比,具有制備簡(jiǎn)單、碳源豐富、耐光漂白、熒光可調(diào)、親水性強(qiáng)、表面易功能化以及生物相容性好等優(yōu)點(diǎn)[2-3],因此在生物傳感、生物成像及藥物載體等領(lǐng)域顯現(xiàn)出重要的應(yīng)用價(jià)值[4-5]。

碳點(diǎn)的制備方法現(xiàn)主要分為兩大類:自上而下法,包括激光消融法[6]、電弧放電法[7]以及電化學(xué)法[8]等,和自下而上法,包括熱解法[9]、水熱法[10]和微波法[11]等。前者系將碳源以切割或氧化的手段由大尺寸變?yōu)榧{米級(jí)尺寸,得到的碳點(diǎn)粒徑均勻,但制備過(guò)程冗長(zhǎng)復(fù)雜、合成條件嚴(yán)苛、碳源較單一、成本高、產(chǎn)率低。而后者系以小分子為前體,通過(guò)一系列化學(xué)反應(yīng)得到目標(biāo)碳點(diǎn),其過(guò)程較簡(jiǎn)單、易于控制、碳源豐富易得、成本較低。不僅有機(jī)小分子[11-12]可作其碳前驅(qū)體,生物碳源[13-16]由于綠色環(huán)保、物種多樣且儲(chǔ)量大的優(yōu)勢(shì)也受到廣泛關(guān)注,比較而言,更適合碳點(diǎn)的宏量制備。目前,生物碳源用于制備碳點(diǎn)多采用簡(jiǎn)單易行的水/溶劑熱法和熱解法,已有文獻(xiàn)報(bào)道以生物碳源進(jìn)行碳點(diǎn)的宏量制備。Sahu等[17]將40 mL橙汁與30 mL乙醇混合,通過(guò)水熱法(120℃、2.5 h)制備出0.4 g碳點(diǎn)。相比于液態(tài)的橙汁,Hsu等[18]采用固態(tài)的咖啡粉作碳源,對(duì)其進(jìn)行高溫?zé)峤?300℃、2 h),從1 g咖啡粉中制得0.12 g碳點(diǎn),產(chǎn)率達(dá)12%。最近,Zhang等[19]以花粉為碳源,水熱(180℃、48 h)合成碳點(diǎn),可從10 g花粉中至少得到3 g碳點(diǎn),其合成產(chǎn)率明顯得到提高,最高達(dá)到了38%。以上方法利用生物碳源宏量合成碳點(diǎn)操作簡(jiǎn)單、可一步制備,無(wú)須使用昂貴儀器。但是,其反應(yīng)過(guò)程需要耗費(fèi)數(shù)小時(shí)甚至數(shù)十小時(shí),而且碳點(diǎn)的合成產(chǎn)率也仍比較低,不利于宏量制備,使碳點(diǎn)的應(yīng)用受到一定限制。所以,急需尋求其他廉價(jià)生物碳源以及簡(jiǎn)單可行且短耗時(shí)的方法合成高產(chǎn)率碳點(diǎn),從而有效地實(shí)現(xiàn)碳點(diǎn)的宏量制備。

酵母是一種微小的單細(xì)胞微生物,富含蛋白質(zhì)、氨基酸以及維生素等多種成分[20],被廣泛用于食品工業(yè)和畜牧業(yè)。易于獲取、綠色無(wú)毒且含碳物質(zhì)豐富的優(yōu)點(diǎn)使酵母可作為比較理想的碳前驅(qū)體來(lái)制備碳點(diǎn)。在自下而上法中,微波法相比于水/溶劑熱法和熱解法,不僅操作容易、可一步合成、設(shè)備要求低,而且反應(yīng)迅速,能在短時(shí)間內(nèi)破壞碳源,促使其轉(zhuǎn)變?yōu)樘键c(diǎn),有望于實(shí)現(xiàn)成本低且耗時(shí)短的高產(chǎn)率宏量制備。本文選用活性干酵母為生物碳源、磷酸為氧化劑,通過(guò)一步微波法快速地合成了產(chǎn)率高、性能好的綠色熒光碳點(diǎn),對(duì)其宏量制備的可行性進(jìn)行了考察,并對(duì)所得碳點(diǎn)進(jìn)行了表征和細(xì)胞毒性評(píng)價(jià),最后成功用于細(xì)胞成像。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要試劑與儀器

主要試劑:磷酸(質(zhì)量分?jǐn)?shù)約40%)、不同pH磷酸鹽緩沖液(PBS)、氫氧化鈉、氯化鈉、硫酸奎寧、活性干酵母。所用試劑均為分析純,實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

主要儀器:U-2910紫外-可見分光光度計(jì)(日本日立公司)，F(xiàn)-4500熒光光譜儀(日本日立公司)，Perkin Elmer 1000紅外光譜儀(美國(guó)珀金埃爾默公司)，Tecnai G2F20 S-Twin場(chǎng)發(fā)射透射電子顯微鏡(美國(guó)FEI公司)，透析袋(美國(guó)聯(lián)合碳化公司)，Millipore Simplicity超純水系統(tǒng)(上海默克化工公司)，冷凍干燥機(jī)(寧波新芝生物科技公司)，F(xiàn)E20酸度計(jì)(上海梅特勒-托利多儀器公司)以及M1-L213B微波爐(中國(guó)美的集團(tuán))。

1.2 碳點(diǎn)的制備

在50 mL玻璃燒杯中分別加入0.5 g活性干酵母顆粒和2 mL磷酸溶液,充分?jǐn)嚢?將所得酵母酸溶液放置于微波爐中,低火檔(119 W)加熱8 min,待自然冷卻至室溫,得到棕黑色液體。加堿中和后,依次用定性濾紙(10～15 μm)和微濾膜(0.22 μm)進(jìn)行過(guò)濾以去除大分子顆粒,然后再轉(zhuǎn)入透析袋(分子截留量500 Da)內(nèi)于超純水中連續(xù)透析48 h以去除鹽類及其他小分子物質(zhì),取袋內(nèi)溶液,即得純化的碳點(diǎn)溶液。將該溶液進(jìn)行冷凍干燥,得到0.254 g的棕黃色碳點(diǎn)粉末。重復(fù)本實(shí)驗(yàn)4次,并按活性干酵母投料量依次為0.5、1、2、5、10 g進(jìn)行擴(kuò)大合成(磷酸溶液加入量隨其比例增加)。

1.3 碳點(diǎn)的表征

將一滴碳點(diǎn)溶液滴在銅網(wǎng)上,待自然晾干后,置于透射電鏡下,觀測(cè)其形貌和尺寸。將碳點(diǎn)粉末與溴化鉀粉末以一定比例均勻混合后,壓制成透明薄片,于紅外光譜儀中分析其特征官能團(tuán)。將盛有碳點(diǎn)溶液的比色皿(光路長(zhǎng)10 mm)分別置于紫外-可見分光光度計(jì)、熒光分光光度計(jì)中測(cè)定其光學(xué)性質(zhì)。將相同質(zhì)量的碳點(diǎn)粉末溶于一系列不同pH磷酸鹽緩沖液和不同濃度NaCl溶液中,分別測(cè)定其熒光強(qiáng)度。配制兩份碳點(diǎn)溶液,一份于365 nm紫外燈下連續(xù)照射6 h,另一份于可見光下放置10 d,每隔一定時(shí)間測(cè)定二者的熒光強(qiáng)度。

1.4 碳點(diǎn)的熒光量子產(chǎn)率

熒光量子產(chǎn)率的測(cè)定以硫酸奎寧作為參比(量子產(chǎn)率為54%),參考文獻(xiàn)所報(bào)道的方法[16],記錄測(cè)定結(jié)果并根據(jù)如下公式計(jì)算得到。

式中φ表示熒光量子產(chǎn)率,K表示發(fā)射光譜的面積積分對(duì)吸光度值作圖所得曲線的斜率,η表示溶劑的折射率,x和st分別表示樣品和標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.5 細(xì)胞毒性及成像實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)采用MTT法檢測(cè)碳點(diǎn)對(duì)細(xì)胞的毒性。取HepG2細(xì)胞懸液于96孔板中,每孔100 μL。放置于培養(yǎng)箱中,在37℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2條件下培養(yǎng)24 h后,棄去上層液,給藥孔中加入含不同濃度CDs(0、10、20、50、100、250和500 mg·mL-1)的新鮮培養(yǎng)基。再孵育24 h后,用含MTT新鮮培養(yǎng)基(5 mg·mL-1)替換所有藥孔中培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)2 h。最后,吸掉上層液,加入DMSO輕搖幾分鐘后,用酶標(biāo)儀在500 nm處測(cè)量吸光度,記錄并處理實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

為了觀察碳點(diǎn)在細(xì)胞中的成像效果,將適量HepG2細(xì)胞懸液加入到共聚焦培養(yǎng)皿中,放置于培養(yǎng)箱,在37℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2條件下進(jìn)行貼壁培養(yǎng)。然后,棄上層液,用PBS緩沖液潤(rùn)洗1次,加入含CDs(500 mg·mL-1)的新鮮培養(yǎng)基,再繼續(xù)培養(yǎng)6 h。最后,取出培養(yǎng)皿,移除培養(yǎng)液,用PBS潤(rùn)洗細(xì)胞3次,鏡油封片,進(jìn)行成像。

2 結(jié)果與討論

2.1 微波加熱時(shí)間對(duì)碳點(diǎn)合成的影響

采用微波法碳化酵母碳源合成熒光碳點(diǎn)。由于碳源的碳化程度影響碳點(diǎn)產(chǎn)率,而加熱時(shí)間對(duì)碳化程度有一定影響,為獲得高產(chǎn)率的碳點(diǎn),考察了微波加熱時(shí)間對(duì)碳源碳化程度的影響。如圖1A所示,隨微波加熱時(shí)間逐漸增加,酵母酸溶液的顏色從乳白色到黃色,到棕黃色,直至變?yōu)樽睾谏?。這表明加熱時(shí)間增加,碳源碳化程度隨之加深,有利于碳點(diǎn)的合成[21]。圖1B所示分別為本實(shí)驗(yàn)所用的活性干酵母顆粒以及所制備的碳點(diǎn)溶液和粉末。

Fig.1 Effect of microwave heating time to carbonization degree of carbon source (A);ADY granules and the as-prepared CDs solution and powder (B)圖1 微波加熱時(shí)間對(duì)碳源碳化程度影響(A)；所用干酵母顆粒及所得碳點(diǎn)溶液和粉末(B)

2.2 宏量制備的可行性考察

平行實(shí)驗(yàn)和擴(kuò)大合成用以考察碳點(diǎn)宏量制備的可行性。如表1所示，所制得碳點(diǎn)的最佳發(fā)射波長(zhǎng)保持在522 nm左右，量子產(chǎn)率保持在13%左右，合成產(chǎn)率保持在50%左右，均無(wú)明顯浮動(dòng)。此外，平行試驗(yàn)和擴(kuò)大合成所得碳點(diǎn)的平均產(chǎn)率分別為50.59%和50.76%，對(duì)應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)偏差值很小，分別為0.98%和1.29%。以上研究結(jié)果說(shuō)明，放大制備對(duì)所得碳點(diǎn)的光學(xué)性質(zhì)沒有產(chǎn)生明顯影響，碳點(diǎn)的合成產(chǎn)率不僅高，并且有很好的重復(fù)性與重現(xiàn)性，可有效實(shí)現(xiàn)宏量制備。

2.3 碳點(diǎn)的形貌與結(jié)構(gòu)表征及分析

如圖2所示，透射電鏡圖與粒徑分布圖表明，碳點(diǎn)為單分散的類球形顆粒，無(wú)團(tuán)聚現(xiàn)象，粒徑分布較窄(2～6 nm)，平均粒徑約為3.4 nm。從粒徑大小和均勻度來(lái)講，通過(guò)微波法獲得的碳點(diǎn)是較為理想的。

表1 制備碳點(diǎn)的平行實(shí)驗(yàn)和其擴(kuò)大合成

Fig.2 TEM image (A) and size distribution diagram (B) of CDs.圖2 碳點(diǎn)的透射電鏡圖(A)與粒徑分布圖(B)

Fig.3 FTIR spectrum of CDs圖3 碳點(diǎn)的紅外吸收光譜圖

圖3為碳點(diǎn)的紅外吸收光譜。其中，以3 350 cm-1為中心的吸收峰屬于O-H和N-H的伸縮振動(dòng)[22]，在1 650、1 401、1 251和1 051 cm-1的吸收峰分別為C=O、C=C、C-O、和C-N的伸縮振動(dòng)[15,23]，而在1 541 cm-1處的吸收峰則與N-H的面內(nèi)彎曲振動(dòng)有關(guān)[22]。以上分析表明，碳點(diǎn)表面存在-OH、-COOH和-NH2，這說(shuō)明以活性干酵母為碳源可為制備的碳點(diǎn)提供豐富的表面官能團(tuán)。這些表面官能團(tuán)可有效加強(qiáng)碳點(diǎn)的親水性，這一點(diǎn)與實(shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)其具有很好的親水性相印證。

2.4 碳點(diǎn)的光學(xué)性質(zhì)表征及分析

對(duì)碳點(diǎn)進(jìn)行紫外-可見吸收光譜、激發(fā)光譜及發(fā)射光譜表征。如圖4A所示，碳點(diǎn)水溶液在281 nm處有強(qiáng)吸收峰，這是由C=C的π-π*躍遷產(chǎn)生的吸收所致[24]；此外，其最大激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)分別位于400 nm和522 nm。如圖4a和b所示，碳點(diǎn)溶液在日光下為淡黃色透明溶液，在365 nm紫外燈下則發(fā)出明亮的綠色熒光。

為了進(jìn)一步探究其發(fā)光特性，不同激發(fā)波長(zhǎng)下的發(fā)射光譜被測(cè)定。從圖4B可看出，當(dāng)激發(fā)波長(zhǎng)從300 nm增長(zhǎng)到460 nm時(shí)，碳點(diǎn)的熒光先增強(qiáng)后減弱，其發(fā)射峰發(fā)生了紅移，這表明碳點(diǎn)的熒光光譜具有激發(fā)依賴趨向，這種激發(fā)依賴的發(fā)射性質(zhì)可能與碳點(diǎn)的表面狀態(tài)或粒徑分布有關(guān)[25]。從熒光光譜的歸一化圖(圖4c)可明顯看出，隨激發(fā)波長(zhǎng)的增加，發(fā)射峰紅移的程度較小，由此可推斷碳點(diǎn)的粒徑分布較均勻，這與先前所得結(jié)論一致。

(A);Emission spectra of CDs with different excitation wavelengths from 300 to 460 nm (1→9) with a 20 nm increment (B).Inset:photographs of CDs solution under sun light (a) and 365 nm UV light (b); and normalized emission spectra of CDs (c)Fig.4 UV-Vis absorption,maximum excitation and emission spectra of CDs(A)；碳點(diǎn)在不同激發(fā)波長(zhǎng)下的發(fā)射光譜(1→9：300→460nm，以20 nm為增幅)(B)； 內(nèi)嵌圖：碳點(diǎn)在可見光(a)和365 nm紫外燈(b)下照片及對(duì)應(yīng)熒光光譜的歸一化圖(c)圖4 碳點(diǎn)的紫外-可見吸收光譜、激發(fā)光譜和發(fā)射光譜圖

2.5 碳點(diǎn)的光穩(wěn)定性考察

以酸堿度、鹽離子濃度、紫外照射時(shí)間和存放時(shí)間為影響因素，考察碳點(diǎn)的光穩(wěn)定性。如圖5A所示，碳點(diǎn)在pH為7.4時(shí)表現(xiàn)出最大熒光強(qiáng)度；在pH 3～11范圍內(nèi)，其熒光強(qiáng)度隨pH的增加無(wú)明顯變化；而在pH=1或13的極酸極堿條件下發(fā)生了明顯的降低。如圖5B所示，碳點(diǎn)在0.25 mol·L-1NaCl溶液中熒光最強(qiáng)，而從整體趨勢(shì)看，NaCl溶液濃度對(duì)熒光的強(qiáng)度影響不大。如圖5C和D所示，碳點(diǎn)的熒光強(qiáng)度隨著紫外照射時(shí)間和存放時(shí)間的加長(zhǎng)而降低的程度均比較弱。以上結(jié)果表明，碳點(diǎn)的光穩(wěn)定性強(qiáng)、耐光漂白性好，可經(jīng)受長(zhǎng)時(shí)間的激發(fā)照射和儲(chǔ)存。

Fig.5 Influences of pH (A),ionic strength (B),UV exposure (C) andstorage time (D) on fluorescence intensity of CDs.圖5 (A)pH(B)鹽離子濃度(C)紫外輻射時(shí)間和(D)存放時(shí)間對(duì)碳點(diǎn)熒光強(qiáng)度影響

2.6 碳點(diǎn)的生物相容性及其細(xì)胞成像研究

Fig.6 HepG2 cellular viability incubated with CDs at different concentrations for 24 h.圖6 HepG2細(xì)胞與不同濃度CDs孵育24 h后的存活率

碳點(diǎn)的MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖6所示，HepG2細(xì)胞生存率隨其濃度增大呈微弱下降趨勢(shì)，當(dāng)濃度高達(dá)500 mg·mL-1時(shí)，其存活率仍達(dá)90%，說(shuō)明碳點(diǎn)對(duì)細(xì)胞的毒性很小，這表明活性干酵母作為碳源合成的熒光碳點(diǎn)具有很好的生物相容性。

圖7為碳點(diǎn)標(biāo)記HepG2細(xì)胞的熒光成像圖。從圖中可以看出，碳點(diǎn)標(biāo)記的細(xì)胞狀態(tài)良好，未觀察到形態(tài)上的損傷，這進(jìn)一步表明碳點(diǎn)良好的生物相容性。碳點(diǎn)進(jìn)入細(xì)胞后，主要分布于細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)中，很少見于細(xì)胞核中，這與之前報(bào)道的結(jié)果是相符的[26]。細(xì)胞在488 nm激發(fā)波長(zhǎng)下發(fā)出明亮的綠色熒光，成像后的細(xì)胞輪廓清楚，且熒光強(qiáng)度穩(wěn)定，說(shuō)明碳點(diǎn)對(duì)細(xì)胞有很好的光學(xué)成像效果。

Fig.7 Fluorescence images of HepG2 cells incubated with CDs (500 mg·mL-1 ) at 37℃ for 6 h. Dark filed (A),bright filed (B) and merge (C) images.A、B、C分別表示暗場(chǎng)、暗場(chǎng)和合場(chǎng)圖像圖7 HepG2細(xì)胞與碳點(diǎn)溶液(500 mg·mL-1)在37℃下孵育6 h后的熒光成像圖

3 結(jié)論

以微波法碳化酵母酸溶液得到綠色熒光的碳點(diǎn)，不但具有碳源廉價(jià)易得、操作簡(jiǎn)單、耗時(shí)短、產(chǎn)率高、可宏量制備的優(yōu)勢(shì)，而且良好的可分散性、親水性、光穩(wěn)定性以及生物相容性使得碳點(diǎn)表現(xiàn)出很好的細(xì)胞成像效果，因此，有望作為熒光探針在生物成像領(lǐng)域得到應(yīng)用。