魏婷婷,周桂旭,石亞偉

(山西大學(xué) 生物技術(shù)研究所,教育部化學(xué)生物學(xué)與分子工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山西 太原 030006)

堿性蛋白酶(Alkaline protease,AP)是一類最適作用pH為堿性的蛋白酶,可水解肽鍵、酯鍵、酰胺鍵。在洗滌劑中用于蛋白污垢如奶漬、血漬、汗?jié)n等的去除;在食品行業(yè)可水解動植物蛋白;在生物技術(shù)領(lǐng)域,用于核酸純化過程中蛋白質(zhì)的去除,如海洋弧菌X4B-7分離的堿性蛋白酶可解聚組蛋白,降解DNA酶[1]。微生物是堿性蛋白酶生產(chǎn)的重要來源,目前用于工業(yè)化生產(chǎn)的菌種主要為芽孢桿菌,如枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、短小芽孢桿菌,嗜堿性芽孢桿菌等[2]。從舟山海域海泥中篩選到產(chǎn)堿性蛋白酶的海洋放線菌A20,其酶活達(dá)104.7 U/mL[3],煙臺近海土壤中篩選到一株產(chǎn)堿性蛋白酶的解淀粉芽孢桿菌,其酶活達(dá)155 U/mL[4],高鹽環(huán)境中分離出的普魯蘭類酵母,產(chǎn)酶活性為7.2 U/mL[5],從發(fā)酵食品中分離出產(chǎn)堿性蛋白酶的短小芽孢桿菌,其酶活為43.67 U/mL[6]。自然界中分離出的產(chǎn)堿性蛋白酶的菌株其產(chǎn)酶活性一般都較低,往往通過菌種誘變、培養(yǎng)基優(yōu)化、基因工程等手段來提高蛋白酶活性。我國堿性蛋白酶主要生產(chǎn)菌地衣芽孢桿菌2709通過誘變育種、 培養(yǎng)條件優(yōu)化,最終使堿性蛋白酶酶活比原初提高了170%[7-8];洗毛用枯草芽孢桿菌通過培養(yǎng)基優(yōu)化使蛋白酶活性提高了33.19%[9];側(cè)孢短芽孢桿菌中胞外蛋白酶BLG4基因克隆到枯草芽孢桿菌WB600中,其酶活是出發(fā)菌株的2.58倍[10];嗜堿性芽孢桿菌PB92中堿性蛋白酶基因分別在大腸桿菌和枯草芽孢桿菌中表達(dá),結(jié)果顯示在枯草芽孢桿菌中比在大腸桿菌中所得酶活高6.8倍[11]。

微生物堿性蛋白酶的分子量多數(shù)在18～35kDa之間[12]。以酪蛋白為底物,pH值為7.0～11.0時,堿性蛋白酶有較高的酶活性[13]。堿性蛋白酶的最適溫度分布范圍較廣,多數(shù)堿性蛋白酶耐熱性不好,有些菌株產(chǎn)生的堿性蛋白酶的最適溫度較高,但是不耐高溫。如假單胞菌KFCC10818產(chǎn)生的堿性蛋白酶的最適作用溫度是70℃,但在70℃保溫15 min完全失活[14]。大多堿性蛋白酶發(fā)揮作用需要金屬離子激活,如Ca2+,Mg2+,Mn2+等,芽孢桿菌屬堿性蛋白酶KP-43具有3個鈣離子結(jié)合位點(diǎn),其熱穩(wěn)定性與3個鈣離子結(jié)合位點(diǎn)密切相關(guān)[15]。

芽孢桿菌具有良好的分泌特性,其發(fā)酵工藝和產(chǎn)物回收技術(shù)也較成熟,是近年常用作外源蛋白的分泌型宿主菌[16]。本文以大豆自然發(fā)酵的菌群為出發(fā)點(diǎn),篩選分離產(chǎn)蛋白酶的活力較高野生菌株,并對菌株進(jìn)行分子分類鑒定,進(jìn)一步利用PCR技術(shù)分離堿性蛋白酶基因,在枯草芽孢桿菌中進(jìn)行重組表達(dá)和酶學(xué)活性分析。

1 材料

1.1 材料與試劑

呂梁臨縣栽培黃豆(晉豆21);pBE2R質(zhì)粒,克隆菌株E.coli×10,表達(dá)菌株WB600均為實(shí)驗(yàn)室保存;限制性內(nèi)切酶KpnⅠ、限制性內(nèi)切酶XbaⅠ、DNA Marker以及EasyPfu DNA Polymerase、T4 DNA Ligase均為北京全式金生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品;卡那霉素、氨芐青霉素為Sigma公司產(chǎn)品;其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 培養(yǎng)基

LB液體培養(yǎng)基:蛋白胨1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同),NaCl 1%,酵母粉0.5%。LB固體培養(yǎng)基:在LB液體培養(yǎng)基基礎(chǔ)上添加瓊脂粉1.5%。脫脂奶粉平板培養(yǎng)基:酵母粉0.5%,蛋白胨1%,NaCl 1%,瓊脂粉1.5%,脫脂奶粉2%。發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基:糊精1%,可溶性淀粉2%,酵母粉 1%,NaCl 0.5%,pH值為7.0[17]。

2 方法

2.1 產(chǎn)酶菌株的篩選

稱取100 g黃豆,將黃豆在100℃水中煮30 min,然后撈出瀝水后,放在培養(yǎng)皿中,不加蓋置于室溫下培養(yǎng),直至豆粒表面產(chǎn)生黏稠狀物質(zhì),吸取少量黏稠狀物質(zhì)于1.5 mL EP管中,加入少量無菌去離子水混勻,梯度稀釋菌懸液。分別吸取100μL不同稀釋梯度的菌懸液均勻涂布于含脫脂奶粉培養(yǎng)基平板上,37℃的恒溫培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)。挑選透明圈直徑與菌落直徑比值較大的單菌落于5 mL的LB培養(yǎng)基中,37℃,200 r/min過夜培養(yǎng),按2%的接菌量轉(zhuǎn)接于發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基中,置于37℃的恒溫振蕩培養(yǎng)器中,200 r/min培養(yǎng)24 h,測定發(fā)酵液的酶活。

2.2 產(chǎn)酶菌株培養(yǎng)及基因組DNA提取

將復(fù)篩所得菌株37℃過夜培養(yǎng),取5 mL過夜培養(yǎng)菌液,13 000 r/min 離心2 min,棄上清,收集菌體,置于-20℃冰箱中保存?zhèn)溆?。基因組DNA提取方法及操作見文獻(xiàn)[18]。

2.3 產(chǎn)酶菌株的鑒定

選用細(xì)菌16SrRNA基因擴(kuò)增通用引物27F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)和1492R(5’-TACCTTGTTACGACTT-3’)以2.2中提取的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,PCR反應(yīng)程序?yàn)?95℃預(yù)變性3 min,95℃變性30 s,55℃退火30 s,72℃延伸1 min 30 s,30個循環(huán),72℃延伸10 min,將擴(kuò)增產(chǎn)物與pEASY-Blunt Zero載體連接并轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α,篩選出陽性克隆并送測序。將測序所得16SrRNA基因序列在GeneBank中進(jìn)行Blast,利用MEGA5.0軟件,繪制系統(tǒng)發(fā)育樹[19]。

2.4 枯草芽孢工程菌構(gòu)建及重組酶液制備

參照Genbank報道的納豆芽孢桿菌中堿性蛋白酶的基因序列(AP011541.2)設(shè)計(jì)引物,上游引物:5’-GGGGTACCATTATAGGTAAGAGAGGAATGTACACATGAGAAGCAAAAAATTG-3’(下劃線部分為加入的KpnⅠ酶切位點(diǎn)),下游引物:5’-GCTCTAGATTATTGTGCAGCTGC-3’(下劃線部分為加入的XbaⅠ酶切位點(diǎn))。以2.2中提取的基因組DNA為模板,擴(kuò)增堿性蛋白酶基因。將AP的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶KpnⅠ和XbaⅠ雙酶切后連接經(jīng)相同酶切后的質(zhì)粒pBE2R,然后轉(zhuǎn)入DH5α感受態(tài)細(xì)胞,篩選轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒,將轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒送北京六合華大基因科技有限公司測序。將測序正確的重組質(zhì)粒pBE2R-AP經(jīng)Spizizen低鹽環(huán)境感受態(tài)轉(zhuǎn)化法[20-21]轉(zhuǎn)入枯草芽孢桿菌WB600過夜培養(yǎng),挑取單菌落,接種于LB液體培養(yǎng)基中,37℃,200 r/min過夜培養(yǎng),按2%的接菌量轉(zhuǎn)接于發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基中,37℃,200 r/min振蕩培養(yǎng)84 h,將發(fā)酵液12 000 r/min離心10 min,上清液即為粗酶液,用于酶學(xué)性質(zhì)研究。

2.5 堿性蛋白酶活力的測定

2.5.1 菌落水解圈

用滅菌槍頭吸取1 μL過夜培養(yǎng)的菌液點(diǎn)于脫脂奶粉平板中,于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,在脫脂奶粉平板上直接觀察是否有透明水解圈出現(xiàn),并用尺子測定透明圈直徑與菌落直徑。

2.5.2 參照輕工業(yè)部頒標(biāo)準(zhǔn)QB-T1803-93(Folin試劑顯色法[22])

1 mL酶液1 min水解酪素產(chǎn)生1 μg酪氨酸所需要的酶量為1個酶活力單位,以U/mL表示。

2.6 重組蛋白酶部分酶學(xué)性質(zhì)研究

2.6.1 酶的最適作用pH和pH穩(wěn)定性

配制一系列pH梯度、終濃度為0.1 mol/L的緩沖溶液:HAc-NaAc(pH5.0)、Na2HPO4-檸檬酸(pH 6.0)、Tris-HCl(pH 7.0～8.0)、Gly-NaOH(pH 9.0～10.0)以及Na2HPO4-NaOH(pH 11.0),用不同pH的緩沖溶液配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的酪素,與相應(yīng)緩沖液稀釋的酶液混合后50℃保溫10 min,Folin法測定酶液在一系列pH條件下的酶活,確定酶液的最適反應(yīng)pH;將酶液分別在一系列pH梯度緩沖液系統(tǒng)中25℃保存l h和24 h,在最適作用條件下測定酶活。以對照酶活為100%,計(jì)算不同pH保存條件下相對酶活[23]。

2.6.2 酶的最適作用溫度和溫度穩(wěn)定性

酶液用pH8.0的緩沖液適當(dāng)稀釋,與質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的酪素混合,在不同溫度下分別保溫10 min,Folin法測酶活。確定酶液的最適反應(yīng)溫度;酶液分別在40、50、60、70℃保溫3 h,每隔30 min在最適pH和最適溫度下測定酶活性,以未保溫的酶液的酶活為100%,計(jì)算相對酶活[24]。

2.6.3 金屬離子、金屬螯合劑對酶活性的影響

酶液中分別加入不同的金屬離子及EDTA,終濃度均為1 mmol/L,對照體系中不加任何化合物,以對照酶活為100%,計(jì)算相對酶活[25]。

2.6.4 不同化學(xué)試劑對酶活性的影響

酶液與不同試劑按一定濃度混合,25℃放置1 h,最適作用條件下測其酶活力,計(jì)算相對酶活[26]。

3 結(jié)果與分析

3.1 產(chǎn)酶菌株篩選結(jié)果

通過脫脂奶粉平板培養(yǎng)基篩選獲得4株透明圈直徑與菌落直徑比值較大的菌株,文獻(xiàn)報道[27],透明圈與菌落直徑的比值與堿性蛋白酶活力高低并非顯著的正相關(guān)。因此,將4株菌株的單菌落接種于5 mL的LB培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng),按2%的接菌量轉(zhuǎn)接于發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基中,置于37℃的恒溫振蕩培養(yǎng)器中培養(yǎng)24 h,測定發(fā)酵液的酶活,最終確定產(chǎn)酶活最高的菌株。結(jié)果如表1所示，BN-2菌株產(chǎn)堿性蛋白酶酶活最高。故將BN-2菌株作為研究對象。

表1 產(chǎn)蛋白酶菌株初篩、復(fù)篩

3.2 產(chǎn)酶菌株的分子生物學(xué)鑒定結(jié)果

以菌株BN-2基因組DNA為模板,擴(kuò)增16S rDNA序列,將目的條帶16S rDNA連接到pEASY-Blunt Zero載體上,將重組載體送測序。測序得到的16SrRNA基因序列在GeneBank中進(jìn)行Blast,結(jié)果顯示,該菌株中16SrRNA基因序列與Bacillussubtilissubsp.nattoBEST195中16SrRNA基因序列(AP011541.2)的同源性達(dá)100%,同時利用MEGA5.0軟件,繪制系統(tǒng)發(fā)育樹。系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建結(jié)果如圖1所示:該菌株和Bacillussubtilissubsp.nattoBEST195遺傳距離最小,親緣關(guān)系最近。

Fig.1 Phylogenetic tree constructed based on 16SrDNA sequence圖1 基于16SrDNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

3.3 枯草芽孢桿菌WB600/pBE2R-AP工程菌構(gòu)建

以菌株BN-2的基因組DNA為模板,擴(kuò)增堿性蛋白酶基因,結(jié)果如圖2所示:目的基因片段大約在1.2kb左右,大小與預(yù)期結(jié)果相符。重組質(zhì)粒pBE2R-AP經(jīng)過雙酶切后出現(xiàn)兩條帶,其大小與預(yù)期大小相符,說明成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒pBE2R-AP。將重組質(zhì)粒pBE2R-AP送北京六合華大基因科技有限公司測序。測序結(jié)果在GeneBank中進(jìn)行Blast,比對結(jié)果顯示該菌株中堿性蛋白酶基因序列與AprE195基因序列同源性達(dá)100%。將測序正確的重組質(zhì)粒pBE2R-AP轉(zhuǎn)入枯草芽孢桿菌構(gòu)建成WB600/pBE2R-AP工程菌。

A.PCR product of AP;B.recombinant vector pBE2R-AP results after double enzyme digestionFig.2 PCR products of AP and Identification of recombinant vector pBE2R-AP by enzyme digestionA. AP的PCR產(chǎn)物;B. 重組載體pBE2R-AP雙酶切后結(jié)果圖2 AP的PCR產(chǎn)物和重組載體pBE2R-AP酶切鑒定

3.4 堿性蛋白酶活性分析

用滅菌槍頭吸取1 μL菌株BN-2、工程菌WB600/pBE2R-AP、不含堿性蛋白酶的WB600/pBE2R的菌液點(diǎn)于脫脂奶粉平板中,于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。在脫脂奶粉平板上,菌株BN-2、工程菌WB600/pBE2R-AP周圍出現(xiàn)透明圈,通過測定得出菌株BN-2透明圈與菌落直徑的比值為1.08,工程菌WB600/pBE2R-AP透明圈與菌落直徑的比值為1.7,不含堿性蛋白酶的工程菌WB600/pBE2R周圍未出現(xiàn)透明圈。同時將2.4中制備的粗酶液用Folin法測定酶活,結(jié)果顯示:相同培養(yǎng)條件下,菌株BN-2產(chǎn)蛋白酶的酶活達(dá)366U/mL,工程菌產(chǎn)蛋白酶的酶活達(dá)438U/mL,每毫升發(fā)酵液中重組蛋白酶比出發(fā)菌株中蛋白酶酶活高1.2倍。

3.5 重組蛋白酶部分酶學(xué)性質(zhì)

3.5.1 酶的最適作用pH

按照2.6.1中的方法測定蛋白酶在一系列pH條件下的酶活性,結(jié)果如圖3所示，該酶的最適作用pH為8.0,屬于弱堿性蛋白酶。對于大部分堿性蛋白酶而言其最適作用pH值為9～11,比如菌株I13產(chǎn)的堿性蛋白酶,其最適作用pH為10.5[28]。海洋氧化短桿菌15E產(chǎn)的堿性蛋白酶最適作用pH值為9.0[29],Baciuussp.所產(chǎn)堿性蛋白酶最適作用pH為10.0～11.0[30]。

3.5.2 酶的最適作用溫度

按照2.6.1中實(shí)驗(yàn)方法測定在不同作用溫度下,蛋白酶活的變化,結(jié)果如圖4所示:該酶的最適作用溫度為50℃。堿性蛋白酶的最適溫度分布范圍較廣,比如嗜堿芽孢桿菌Bacillussp B18的蛋白酶最適溫度能達(dá)到85℃[31],從深海真菌中分離的一種堿性蛋白酶,最適反應(yīng)溫度為45℃[32]。

Fig.3 Optimal reaction pH of protease圖3 蛋白酶最適作用pH

Fig.4 Optimum reaction temperature of protease圖4 蛋白酶最適反應(yīng)溫度

3.5.3 酶的熱穩(wěn)定性

酶液按照2.6.2中實(shí)驗(yàn)方法分別在40℃、50℃、60℃、70℃保溫3 h,每隔30 min在最適反應(yīng)條件下,測定一次酶活。結(jié)果如圖5所示:該酶在40℃中處理3 h時其相對酶活為60%,在50℃中處理30 min時殘余酶活力僅為51%,說明其耐熱性不好。一般而言芽孢桿菌和弧菌等細(xì)菌產(chǎn)的堿性蛋白酶比較耐熱。如短桿菌產(chǎn)生的堿性蛋白酶在50℃和60℃分別保溫60 h和7 h仍保持50%的酶活力[33],但也存在耐熱性差的一些堿性蛋白酶,如嗜堿菌S9產(chǎn)的堿性蛋白酶在50℃中處理10 min時殘余酶活力僅為60%左右[34],其穩(wěn)定性比我們分離到的堿性蛋白酶的穩(wěn)定性還差。

3.5.4 酶pH的穩(wěn)定性

酶液按照2.6.2中方法在一系列pH緩沖液系統(tǒng)中25℃保存1 h和24 h,在最適反應(yīng)條件下測定酶活。結(jié)果如圖6所示，該酶在pH 7.0～9.0緩沖液中保存24 h后,至少保持75%的酶活性,顯示較好的耐弱堿性,在pH為8.0時最穩(wěn)定,殘余酶活力達(dá)94%。

Fig.5 Thermal stability of protease圖5 蛋白酶的熱穩(wěn)定性

Fig.6 pH stability of protease圖6 蛋白酶的pH穩(wěn)定性

3.5.5 不同金屬離子、金屬離子螯合劑對酶活的影響

Fig.7 Effects of metal ions and metal ion chelating agents on the activity of protease圖7 金屬離子、金屬離子螯合劑對蛋白酶活性的影響

按照2.6.3中的實(shí)驗(yàn)方法在酶液中分別加入不同金屬離子及EDTA,使其終濃度均為1 mmol/L,在最適反應(yīng)條件下測定酶活性。結(jié)果如圖7所示:Ca2+、Mn2+能有效激活酶活力,尤其1 mmol/L的Mn2+對該酶活性有48%的促進(jìn)作用,1 mmol/L的Ca2+對該酶活性有8%的促進(jìn)作用,1 mmol/L的Cu2+對該酶活性有85%的抑制作用,其余金屬離子對該酶活性有輕微抑制作用。EDTA對酶活性也有20%的抑制作用,說明該酶可能為金屬離子依賴型酶。

3.5.6 洗滌劑組分對酶活的影響

按照2.6.4中實(shí)驗(yàn)方法,酶液與不同濃度、不同洗滌劑組分按一定比例混合,25℃放置1 h,在最適反應(yīng)條件下測其酶活力(表2)。結(jié)果表明:不同洗滌劑對該酶活性有不同程度的抑制作用。體積分?jǐn)?shù)為1%的TritonX-100、Tween20、Tween80對該酶活性的抑制作用相對較小。

4 結(jié)論

我們從自然發(fā)酵的大豆中通過初篩、復(fù)篩得到一株產(chǎn)蛋白酶活性較高的菌株BN-2,經(jīng)16S rDNA特征片段比較分析,初步確定該菌株為Bacillussubtilissubsp.nattoBEST195。Bacillussubtilissubsp.nattoBEST195作為納豆菌的一種,已經(jīng)完成了全基因組測序,但其中的堿性蛋白酶的卻鮮有研究工作[35-37]。重組堿性蛋白酶比出發(fā)菌株中堿性蛋白酶酶活高1.2倍,可能和pBE2R載體中含P43組成型啟動子有關(guān),何小丹等人的研究也證實(shí)B.licheniformisYPlA來源的堿性蛋白酶基因在P43強(qiáng)啟動子的作用下其表達(dá)能力明顯優(yōu)于堿性蛋白酶自帶的啟動子,其酶活比出發(fā)菌株酶活高4.39倍[38]。對于大部分堿性蛋白酶而言其最適作用pH值為9～11,但該菌株中堿性蛋白酶的最適作用pH為8.0,相比較作用條件更為溫和。Mn2+對大部分的堿性蛋白酶酶活有抑制作用但本實(shí)驗(yàn)中1 mmol/L的Mn2+對該菌株中的堿性蛋白酶酶活有48%的促進(jìn)作用,這與文獻(xiàn)報道[39]1 mmol/L的Mn2+對放線菌來源的一種堿性蛋白酶的酶活有13%的促進(jìn)作用相一致。相反,Cu2+對所有堿性蛋白酶的酶活都有明顯的抑制作用,比如1 mmol/L的Cu2+對綠假單胞菌中堿性蛋白酶活性有26%的抑制作用[40],而本實(shí)驗(yàn)中1 mmol/L的Cu2+對該菌株中酶活性有85%的抑制作用,其抑制效果更為明顯。1 mmol/L的EDTA對該菌株中堿性蛋白酶活性也有20%的抑制作用,表明該酶可能為金屬離子依賴型酶。洗滌劑組分中TritonX-100、Tween20可以使某些堿性蛋白酶活性有所提升,但在本文中洗滌劑中各組分在1%濃度下對該酶的略微抑制作用。在下一步研究中,將利用蛋白質(zhì)工程的手段進(jìn)一步提高酶活性以及pH穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性,使其適合在工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用。

表2 洗滌劑組分對酶活性的影響