方寧 劉娟花

(1咸陽職業(yè)技術(shù)學院，陜西 咸陽 712046；2陜西中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院)

哮喘是由多種細胞(以肥大細胞、嗜酸粒細胞浸潤為主)和細胞組分參與的慢性氣道炎癥性疾病，以氣道高反應及慢性氣道炎性反應為主要特征。加味蘇子降氣湯對哮喘患者在緩解癥狀、降低副作用等方面均有較好的療效。本實驗通過觀察加味蘇子降氣湯對哮喘大鼠體內(nèi)細胞因子水平的影響及對免疫網(wǎng)絡(luò)的調(diào)節(jié)，進一步探討加味蘇子降氣湯治療腎陽虛證哮喘的免疫機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物 清潔級SD大鼠,雄性,40只，體重(160±20)g，月齡6～9個月，由西安交大實驗動物中心提供，實驗前于實驗室正常飼養(yǎng)1 w，分籠飼養(yǎng)，自由進食進水，飼料由西安交大實驗動物中心統(tǒng)一提供，為標準顆粒飼料。飼養(yǎng)實驗室采光、通風良好，室溫約25℃。

1.2藥物及試劑 加味蘇子降氣湯由紫蘇子、半夏、當歸、前胡、厚樸、肉桂、甘草等中藥組成，購于陜西中醫(yī)藥大學校醫(yī)院。采用自動煎藥機煎藥，密封包裝，每包100 ml，每毫升含生藥 1 g。哮喘模型致敏劑卵清白蛋白(OVA)，Sigma公司產(chǎn)品(分裝)；氫氧化鋁，購于天津市博迪化工有限公司；滅活百日咳桿菌疫苗來自上海生物制品研究所；靈芝孢子粉，購自陜西大至醫(yī)藥有限公司。白細胞介素(IL)-4、干擾素(IFN)-γ檢測所用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒購于武漢博士德公司。

1.3主要器材 FAl004N電子天平，上海精密科學儀器公司；CC2170A超聲霧化器，成都維信電子科大新技術(shù)有限公司；SHHW21-600電熱恒溫水箱，天津市泰斯特有限公司；RT-2100C酶標分析儀，深圳雷杜電子有限公司。

1.4動物分組及哮喘模型制造 大鼠隨機分為正常對照組、哮喘模型組、加味蘇子降氣湯組和地塞米松組，每組10只。除正常對照組外，其余3組參照文獻〔1〕制造哮喘模型。首先進行致敏，分別于第1、7天經(jīng)腹腔及四肢末端注射致敏液1 ml(含OVA 0.1 g，氫氧化鋁0.1 g，百日咳桿菌原液5×109個/ml)；于第14天開始，將模型大鼠置于密閉容器內(nèi)，霧化吸入1% OVA溶液，1次/d，20 min/次，持續(xù)霧化吸入5 d，隨后減為隔日1次霧化，執(zhí)行至第28天。哮喘模型激發(fā)成功的標志：每次霧化時，大鼠出現(xiàn)抖毛、咳嗽、腹式呼吸、煩躁，甚至跌倒、抽搐等表現(xiàn)。正常對照組給予生理鹽水代替致敏液進行致敏，致敏方式和方法同其余3組。

1.5用藥 地塞米松組、加味蘇子降氣湯組于激發(fā)第1天開始給藥。劑量：地塞米松組給予地塞米松 0.25 mg·kg-1·d-1，加味蘇子降氣湯組給予加味蘇子降氣湯2 ml·kg-1·d-1；正常對照組、哮喘模型組給予生理鹽水2 ml·kg-1·d-1。給藥方式均為灌胃。

1.6標本采集與檢測 將實驗大鼠按1.5 g/kg腹腔注射20%烏拉坦溶液，麻醉。肺泡灌洗法參照文獻〔2〕，將大鼠固定在手術(shù)板上，常規(guī)消毒，剪開頸部皮膚，鈍性分離，暴露氣管，用手術(shù)線結(jié)扎左肺，在頸部暴露氣管做一橫切口，將圓頭7號針頭進針約1.0 cm,以“0”號手術(shù)線結(jié)扎固定，對右肺用生理鹽水(37℃)3 ml進行支氣管肺泡灌洗，每次保留30 s后抽出，如此反復3次,動作宜輕柔，肺泡灌洗液回收總量約8 ml，3 000 r/min離心15 min，取上清液放入Eppendof管中待測。采用ELISA檢測肺泡灌洗液中IL-4、IFN-γ水平操作參照試劑盒說明書進行。

1.7統(tǒng)計學方法 應用SPSS17.0 軟件行t檢驗。

2 結(jié) 果

哮喘模型組肺泡灌洗液中IL-4含量明顯高于正常對照組，IFN-γ含量明顯低于正常對照組，差異有顯著統(tǒng)計學意義(P<0.01)；與哮喘模型組相比，加味蘇子降氣湯組、地塞米松組肺泡灌洗液中IL-4水平明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，IFN-γ水平明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。加味蘇子降氣湯組與地塞米松組IL-4、IFN-γ水平比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組肺泡灌洗液中IL-4、IFN-γ 水平比較

與正常對照組比較：1)P<0.01；與哮喘模型組比較：2)P<0.05

3 討 論

哮喘是與免疫功能紊亂相關(guān)的氣道慢性炎癥性疾病〔3,4〕。此外，分子免疫學深入研究發(fā)現(xiàn)，輔助性T細胞(Th)亞群Th1和Th2之間存在著交互調(diào)節(jié)的關(guān)系，Th1/Th2失衡是哮喘發(fā)病的重要免疫學機制〔5〕，Th2分泌的細胞因子IL-4可誘發(fā)哮喘患者體內(nèi)免疫球蛋白(Ig)E的生成。哮喘患者體內(nèi)IL-4異常增高，Th2型免疫反應過高；哮喘患者體內(nèi)Th1降低，IFN-γ生成低下，使IgE生成增加。Th1和Th2相互拮抗調(diào)節(jié)機體正常的免疫應答。Th1分泌的細胞因子IFN-γ能抑制哮喘發(fā)作〔6〕。

哮喘大多自幼發(fā)病，先天不足是其根本，其中又有部分在中年以后，因腎中陽氣漸虧而哮喘宿疾復發(fā)。腎陽虧虛是哮喘宿根形成之本〔7〕。蔣朱秀等〔8〕用相同方法致敏的哮喘模型實驗中，哮喘模型組大鼠血清中T 降低，證實哮喘模型大鼠有腎陽虛證及相關(guān)癥候。蘇子降氣湯源自《太平惠民和劑局方》，是中醫(yī)學治療“上實下虛”型哮喘的名方；加味蘇子降氣湯在此基礎(chǔ)上，加大了溫補腎陽的功效〔9〕。方中紫蘇子、半夏、當歸、前胡、厚樸、肉桂、甘草等諸藥合用可有效鎮(zhèn)咳、祛痰、平喘，作用大且分散,水溶性強，起效快，鎮(zhèn)咳作用可直達咳嗽中樞，鎮(zhèn)咳成分為生物堿〔10〕。最終方劑通過下調(diào)IL-4、上調(diào)IFN-γ水平達到調(diào)節(jié)Th1/Th2細胞因子平衡的目的。Th1/Th2模式與中醫(yī)學的陰陽學說、虛實證候、臟象學說等均有密切關(guān)系，細胞因子網(wǎng)絡(luò)可能是中醫(yī)證候的重要物質(zhì)基礎(chǔ)。故研究Th1/Th2失衡和IgE分泌是防治哮喘的新途徑〔11,12〕。本實驗結(jié)果顯示加味蘇子降氣湯能明顯降低哮喘大鼠IL-4含量，升高IFN-γ水平，改善Th1/Th2失衡，從而達到防治哮喘的作用。