賈碩 孫艷 張穎宏 王宏竹 盛春華

(1中南大學湘雅二醫(yī)院，湖南 長沙 410011；2解放軍第208醫(yī)院；3吉林大學第二醫(yī)院)

肝癌具有發(fā)病隱匿、易轉移復發(fā)及預后差等特征，患者生存期短，死亡率高，即使預后較好的小肝癌，術后也有超過70%的患者在2年內發(fā)生復發(fā)或遠處轉移，而高達90%以上的肝癌術后死亡因素與轉移復發(fā)有關〔1〕。研究證實，腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、治療耐藥和容易復發(fā)轉移的根本原因在于患者體內存在腫瘤干細胞(CSCs)〔2〕。CSCs雖然數(shù)量很少，但很難殺滅，常規(guī)放化療只能去除腫瘤組織中大多數(shù)增殖細胞，不能去除CSCs〔3〕。在殺滅大部分已分化的腫瘤細胞后(手術、放療、化療后)，再予以CSCs的靶向治療，將可能是腫瘤治療的新方案。肝癌手術后，殘存在血液、淋巴循環(huán)及組織中的CSCs是復發(fā)和轉移的根源〔4〕。CD133是目前比較明確的CSCs的表面標志〔5〕，本研究篩選CD133+CSCs，制備裸鼠肝癌模型，再以CSCs為靶點，體外誘導擴增樹突細胞(DC)和細胞毒性T淋巴細胞(CTL)，觀察體內實驗中CSCs抗原致敏的DC-CTL對肝癌的抑制作用，為CSCs的臨床靶向治療奠定實驗基礎。

1 材料與方法

1.1主要材料試劑與儀器 GTT-551、DMEM細胞培養(yǎng)基、人AB血清(Gibco公司)；細胞因子白細胞介素(IL)-2、干擾素(IFN)-γ、IL-1α、IL-4、粒細胞單核細胞集落刺激因子(GM-CSF)、腫瘤壞死因子(TNF)-α(美國Peprotech公司)；抗人CD3單克隆抗體、CD8單克隆抗體、小鼠抗人單克隆抗體CD133-PE(美國BD公司)；ClinicMacs流式細胞儀(美國Beckman Coulter公司)，全自動磁性細胞分選儀(德國Miltenyi公司)。BABL/c雄性裸小鼠(上海斯萊克實驗動物有限責任公司)15只，4～5周齡，體重18～20 g。

1.2，CSCs的分選 明確診斷肝細胞性肝癌患者手術后取肝癌組織，用生理鹽水加入慶大霉素(100 U/ml)清洗，剪切組織塊，加入胰蛋白酶液置于37℃孵箱中消化，并間斷用攪拌棒攪拌，消化4 h，用200目濾篩過濾，重新制備成單細胞懸液，加生理鹽水離心800 r/min 10 min，2次，應用高糖DMEM培養(yǎng)基加8%人AB血清接種于6孔板中，密度2×106/ml。嚴格應用磁珠分選系統(tǒng)說明書進行細胞分選操作。制備肝癌單細胞懸液，與CD133抗體磁珠進行交聯(lián)后過分離柱進行分選，收集CD133+細胞，制備成CSCs單細胞懸液備用。

1.3流式細胞技術測定CSCs 取分選前的肝癌細胞懸液和分選后的CD133+細胞懸液，分別加入2 ml圓底離心管中，離心1 500 r/min，5 min，棄上清液。加入磷酸鹽緩沖液(PBS) 1 ml離心洗滌1次，棄上清。調整細胞濃度，加入Fc受體封閉劑，4℃避光反應10 min。離心，棄上清液。用PBS 1 ml洗滌1次，離心。分別加入CD133-PE抗體，將上述2份細胞放在冰盒里避光孵育30 min，用1 ml含體積分數(shù)10%胎牛血清PBS洗滌2次，應用流式細胞儀分析測定CD133+細胞。

1.4CSCs和肝癌細胞抗原的獲得 分別收集CSCs和肝癌細胞，用PBS調整密度為5×106/ml，細胞被反復凍融(-196～37℃)，循環(huán)4次。細胞裂解物經12 000 r/min離心5 min，取上清經濾器除菌后按Bradford蛋白濃度測定試劑盒說明書所示方法測量、計算抗原的蛋白濃度，分裝后-70℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.5分別培養(yǎng)CSCs和肝癌細胞抗原致敏的DC-CTL

1.5.1外周血單個核細胞分別誘導擴增DC和細胞因子誘導的殺傷細胞(CIK) 肝癌患者(與上文獲得肝癌干細胞為同一患者)手術1個月后，應用血液成分分離機進行單個核細胞單采，經Ficoll淋巴細胞分離液從單個核細胞分離淋巴細胞。用GTT-551培養(yǎng)基洗滌2次，用GTT-551培養(yǎng)基加入6%人AB血清混懸于培養(yǎng)瓶中，置37℃、5%CO2孵育箱中，2 h后將懸浮細胞移出進行CIK培養(yǎng)，貼壁細胞進行DC培養(yǎng)。

1.5.2CSCs和肝癌細胞抗原致敏的DC培養(yǎng) 貼壁細胞加入IL-4(500 U/ml)，GM-CSF(1 000 U/ml)培養(yǎng)，每隔2～3 d換液1次，第6天分別加入CSCs和肝癌細胞抗原100 μg/ml，第7天加入TNF-α(500 U/ml)誘導DC成熟，第9天分別收獲成熟DC細胞。

1.5.3CIK培養(yǎng) 懸浮淋巴細胞加入重組人IFN-γ(1 000 U/ml)和10%AB型人血清的GTT-551培養(yǎng)液，24 h后更換成含100 ng/ml小鼠抗人CD3單克隆抗體、IL-1α(1 000 U/ml)和 IL-2(500 U/ml)的完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，2 d后換含IL-2(500 U/ml)的完全培養(yǎng)液隔日換液維持培養(yǎng)9 d。

1.5.4分選CTL 參照ClincMacs使用說明，加入CD3、CD8抗體磁珠，應用CliniMacs流式細胞儀從誘導擴增的CIK中分選出CD3+CD8+T淋巴細胞。

1.5.5抗原致敏后的DC與CTL共培養(yǎng)，獲得DC-CTL 細胞培養(yǎng)第9天，分別取CSCs和肝癌細胞抗原致敏后的DC，經活細胞計數(shù)后，按1∶5分別與CD3+CD8+T細胞混合培養(yǎng)，每2天加入IL-2(500 U/ml)半量換液，5 d后收集，獲得分別CTL。細胞質量控制標準：細胞存活率≥95%，不含細菌、病毒和內毒素等微生物。

1.6檢測抗原致敏的DC-CTL對裸鼠肝癌的抑瘤作用

1.6.1造模 將生長狀態(tài)良好的人CSCs制備成為單細胞懸液，以1×106/只，注射到BABL/c裸小鼠右側腋下，每天觀察小鼠的飲食及精神狀態(tài)，8 d后可見小鼠右側腋下長出腫瘤，成瘤率為100%。

1.6.2分組實驗 將無差異造模成功裸鼠隨機分為3組，每組5只：生理鹽水對照組，CSCs抗原致敏組，肝癌細胞抗原致敏組。3組分別給予尾靜脈注射：生理鹽水、CSCs抗原致敏的DC-CTL、肝癌細胞抗原致敏的DC-CTL。每次1×108/0.5 ml。每3 d治療1次，治療5次，末次治療2 w后處死裸鼠，剝出瘤塊，用電子天平稱取瘤重，計算抑瘤率。

1.6.3計算抑瘤率 抑瘤率(%)=(對照組平均腫瘤重量-實驗組平均腫瘤重量)/對照組平均腫瘤重量×100%。

1.7統(tǒng)計學方法 應用SPSS13.0軟件進行t檢驗、單因素方差分析。

2 結 果

2.1流式細胞技術測定CSCs CD133表達達到98.4%，說明分選成功，得到的細胞基本為具有CD133+標志的CSCs。

2.2抗原致敏DC培養(yǎng) DC培養(yǎng)至第9天在顯微鏡下觀察，DC呈圓形，貼壁生長，表面有樹突狀突起。應用流式細胞技術測定DC表面標志，說明為成熟DC。

2.3CIK培養(yǎng) 流式細胞術測定細胞誘導擴增前CD3+CD8+細胞含量約為48%，細胞誘導擴增9 d，CIK中CD3+CD8+含量約達90%，并且細胞總數(shù)量隨誘導時間大幅擴增，第1天CIK數(shù)量為(1.05±0.05)×106/ml，第7天CIK數(shù)量為(56.33±1.85)×106/ml，第9天CIK數(shù)量為(112.19±2.17)×106/ml，第9天擴增100余倍。

2.4動物實驗結果 與生理鹽水對照組相比，無論是肝癌細胞抗原致敏組還是肝癌CSCs抗原致敏組對腫瘤都具有極顯著的抑制作用(P<0.01)，CSCs抗原致敏組較肝癌細胞抗原致敏組抑瘤率顯著增高(P<0.05)，見表1，說明CSCs抗原致敏的DC-CTL對肝癌具有更強的抑制作用。見圖1，表1。

圖1 抗原致敏的DC-CTL對裸鼠肝癌的抑制作用

組別瘤重量(g)抑瘤率(%)生理鹽水對照組6.918±1.6070.00肝癌細胞抗原致敏組3.679±1.05654.241)CSCs抗原致敏組2.502±0.83365.081)2)

與生理鹽水對照組比較：1)P<0.01；與肝癌細胞抗原致敏組比較：2)P<0.05

3 討 論

近年來隨著CSCs生物學研究的深入，CSCs揭示了肝癌的發(fā)生發(fā)展，普遍認為CSCs是肝癌的種子細胞，在肝癌的增殖、轉移等多種重要生物學過程中具有決定性作用。對CSCs進行有效抑制，可能是肝癌治療的關鍵〔6，7〕。研究認為，CSCs對放化療耐藥，術后復發(fā)轉移是患者最終死亡的主要原因，而CSCs逃脫免疫系統(tǒng)監(jiān)視清除是復發(fā)轉移的根源。人體抗腫瘤免疫主要為細胞免疫，介導細胞免疫的主要是T淋巴細胞和NK細胞。在T淋巴細胞介導的細胞免疫中CD3+CD8+細胞即效應細胞毒性T細胞主要發(fā)揮識別和殺傷腫瘤細胞的作用。肝癌患者往往細胞免疫功能低下，腫瘤免疫原性差，不能有效提呈給DC細胞，機體難以產生針對性的CD3+CD8+T細胞。CD133是CSCs明確的表面標志。本研究根據(jù)CD133分子標志從肝癌組織中篩選人CSCs，進一步獲得CSCs抗原。從病人外周血中分離單個核細胞，分別誘導和擴增人CSCs抗原致敏的DC和CIK。以CSCs為靶標，通過MTT實驗觀察其靶向性殺傷CSCs的作用。DC是人體內功能最強大的抗原呈遞細胞，能有效激活初始T細胞，誘導出抗原特異性CTL，使機體產生抗腫瘤免疫反應?？乖旅艉驞C的增殖活性和對抗原的識別作用均增強〔8〕。CIK是人體外周血單個核細胞在體外用多種細胞因子誘導而獲得的一種異質性T細胞〔9〕，增殖能力強，短期培養(yǎng)后即可達到抗腫瘤效應細胞的數(shù)量。CIK對腫瘤細胞的毒性是非主要組織相容性(MHC)限制的，并且對一般的腫瘤干細胞也具有細胞毒性〔10〕。它通過釋放細胞顆粒、激活腫瘤細胞凋亡基因、活化死亡受體caspase級聯(lián)反應、分泌多種細胞因子抑制腫瘤細胞、間接調節(jié)免疫功能等機制，發(fā)揮其對腫瘤細胞廣譜、高效的殺傷作用。CIK富含大量CTL。通過臨床應用級別的ClinicMacs流式細胞儀分選出CD3+CD8+的CTL細胞與DC共培養(yǎng)后，細胞間的相互作用能促進二者的成熟和增殖，增加DC和共刺激分子遞呈抗原的特異性，促進DC分泌IL-2〔12〕。本研究結果顯示，DC-CTL對肝癌細胞具有直接的殺傷作用。CSCs抗原致敏的DC-CTL對CSCs可能產生了靶向性的識別和殺傷作用，對于臨床患者手術后進行CSCs的清除治療具有一定參考意義。