安方玉 顏春魯 劉永琦 伍志偉 蘇韞 高軍太

(1甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，甘肅 蘭州 730000；2甘肅省高校重大疾病分子醫(yī)學(xué)與中醫(yī)藥防治研究省級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；3平?jīng)鍪兄嗅t(yī)醫(yī)院)

當(dāng)前，隨著工業(yè)的發(fā)展，金屬鎘污染逐漸成為威脅人類健康的重要危險(xiǎn)因素之一〔1〕。因此，對(duì)鎘污染造成機(jī)體多器官多系統(tǒng)的損傷也備受關(guān)注〔2〕。有相關(guān)研究報(bào)道，鎘污染機(jī)體后會(huì)造成脂質(zhì)過(guò)氧化損傷和免疫損傷〔3,4〕，但具體機(jī)制未明。黃芪作為甘肅的道地藥材，有大量研究證實(shí)，其具有良好的抗氧化、增強(qiáng)機(jī)體免疫力等功能〔5～8〕。為此，本實(shí)驗(yàn)建立大鼠鎘染毒模型，通過(guò)觀察黃芪提取物黃芪多糖對(duì)染鎘大鼠免疫功能及氧化功能的影響，初步探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)Wistar大鼠36只，體重(180±20)g，雌雄各半，由甘肅中醫(yī)藥大學(xué)科研實(shí)驗(yàn)中心提供。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證編號(hào)：SCXK(甘)2011-0001-0001344。

1.2主要試劑 氯化鎘(天津市巴斯夫化工有限公司，批號(hào)：20081010)；羧甲基纖維素鈉 (天津市大茂化學(xué)試劑廠，批號(hào)：110311)；考馬斯亮藍(lán)試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號(hào)：20140309)；超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、乳酸脫氫酶(LDH)檢測(cè)試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號(hào)分別為：20160621、20160627、20160820、20160721、20160728)；鼠白細(xì)胞介素(IL)-2酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒和鼠轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)-β ELISA試劑盒(上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)分別為20160718A和201600721A)。

1.3實(shí)驗(yàn)藥物及給藥劑量 藥材選用甘肅地道藥材黃芪，由甘肅中醫(yī)藥大學(xué)科研實(shí)驗(yàn)中心藥物制劑實(shí)驗(yàn)室提取、分離、鑒定(純度達(dá)到50%以上)。黃芪多糖給藥量：20 mg/kg，用0.5%的羧甲基纖維素配成所需濃度(2 mg/ml)(批號(hào)：GR20120920AS2)。

1.4主要儀器 全自動(dòng)酶標(biāo)分析儀(美國(guó)Bio-Rad公司，型號(hào)iMark)；電子天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司，型號(hào)FA2004N)；ZY12306型微量加樣器(ScienTiFic產(chǎn)品)；T6新悅-可見分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)；TDZ5-WS型醫(yī)用離心機(jī)(湖南平凡科技有限公司)。

1.5動(dòng)物分組、造模及給藥 SPF級(jí)Wistar大鼠36只，雌雄各半，體重(180±20)g，適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后，按照隨機(jī)數(shù)字表法分為3組：空白對(duì)照組、模型組、黃芪多糖組。每組12只。 空白對(duì)照組腹腔注射0.9%NaCl，模型組和黃芪多糖組均腹腔注射0.1%氯化鎘，按1.5 mg/kg注射，相當(dāng)于1.5 ml/kg，每周5次，共5 w。染毒的同時(shí)給予黃芪多糖(20 mg·kg-1·d-1)灌胃治療，每天1次，連續(xù)5 w。末次給藥后，取血，脾臟、胸腺備用。

1.6鎘染毒大鼠體重及免疫器官指數(shù)的測(cè)定 末次給藥24 h后，稱量大鼠體重，股動(dòng)脈采血處死大鼠，摘取脾臟、胸腺等組織稱重，分別計(jì)算脾臟指數(shù)及胸腺指數(shù)。脾臟(胸腺)指數(shù)=脾臟(胸腺)質(zhì)量(mg)/體重(g)。

1.7脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn) 常規(guī)制備脾淋巴細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為1×106/ml，設(shè)立Con A 刺激組和對(duì)照組。Con A 刺激組和對(duì)照組均加入100 μl脾細(xì)胞懸液，其中Con A 刺激組加入10 μl Con A(終濃度為5 μg/ml)，對(duì)照組加入10 μl含血清 RPMI1640培養(yǎng)液，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)68 h。每孔加入10 μl MTT(終濃度為5 mg/ml)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，離心、棄上清，每孔加入150 μl DMSO裂解液溶解，振蕩混勻。于570 nm處讀取各孔OD值，計(jì)算淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化OD值和刺激指數(shù)(SI)。淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化OD值=(實(shí)驗(yàn)組孔OD值-對(duì)照組孔OD值)，SI=實(shí)驗(yàn)組孔OD值÷對(duì)照組孔OD值×100%。

1.8NK細(xì)胞殺傷活性檢測(cè) 常規(guī)制備脾淋巴細(xì)胞懸液，調(diào)脾細(xì)胞濃度為2×106/ml，K562細(xì)胞濃度為1×105/ml，設(shè)立對(duì)照組和靶細(xì)胞組。對(duì)照組和靶細(xì)胞組均每孔加入 50 μl K562 細(xì)胞懸液，培養(yǎng)1 h后，靶細(xì)胞組每孔加入50 μl脾細(xì)胞懸液，對(duì)照組每孔加50 μl完培。在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20 h后，每孔加入10 μl MTT(終濃度為5 mg/ml)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，離心、棄上清，每孔加入150 μl DMSO，振蕩混勻。測(cè)定570 nm處各孔的A值，計(jì)算NK殺傷率。NK殺傷率=〔(靶細(xì)胞A值-對(duì)照組A值)÷靶細(xì)胞A值×100%〕。

1.9脾臟白細(xì)胞介素(IL)-2和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)-β1含量的測(cè)定 ELISA法測(cè)定脾臟IL-2及TGF-β1的含量，具體操作按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

1.10脾臟SOD活性和MDA含量的測(cè)定 制備脾臟勻漿液，1 500 r/min離心，15 min，取上清，比色分析法測(cè)定脾臟抗氧化酶SOD活性和氧化產(chǎn)物MDA的含量，具體操作按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

1.11血清AST、ALT、LDH活性的測(cè)定 大鼠末次給藥24 h后，動(dòng)脈采血5 ml，注入試管內(nèi)，靜置2 h，3 000 r/min離心，10 min，分離血清，比色分析法測(cè)定血清中AST活性、ALT活性和LDH活性，具體操作按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

1.12統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1黃芪多糖對(duì)鎘染毒大鼠體重、胸脾指數(shù)的影響 與空白對(duì)照組比較，模型組大鼠體重、胸脾指數(shù)顯著降低(P<0.01)。與模型組比較，黃芪多糖組大鼠體重、胸脾指數(shù)顯著增加(P<0.05)。見表1。

表1 各組體重、脾臟指數(shù)及胸腺指數(shù)比較

與空白對(duì)照組比較：1)P<0.01；與模型組比較：2)P<0.05

2.2黃芪多糖對(duì)鎘染毒大鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化能力的影響 與空白對(duì)照組比較，模型組大鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化能力及刺激指數(shù)(SI)顯著降低(P<0.05或P<0.01)。與模型組比較，黃芪多糖組大鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化能力及SI顯著增加(P<0.05或P<0.01)。見表2。

表2 各組淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化OD值及SI比較

與空白對(duì)照組比較：1)P<0.05，2)P<0.01；與模型組比較：3)P<0.01

2.3黃芪多糖對(duì)鎘染毒大鼠NK細(xì)胞殺傷活性的影響 與空白對(duì)照組比較，模型組大鼠NK細(xì)胞殺傷活性明顯降低(P<0.01)。與模型組比較，黃芪多糖組大鼠NK細(xì)胞殺傷活性顯著增加(P<0.01)。見表3。

2.4黃芪多糖對(duì)鎘染毒大鼠脾臟IL-2和TGF-β1含量的影響 與空白對(duì)照組比較，模型組大鼠脾臟組織IL-2含量顯著降低，TGF-β1含量顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，黃芪多糖組脾臟組織大鼠IL-2含量顯著增加，TGF-β1含量顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。見表4。

2.5黃芪多糖對(duì)鎘染毒大鼠脾臟SOD和MDA的影響 與空白對(duì)照組比較，模型組大鼠脾臟組織SOD活性顯著降低，MDA含量顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，黃芪多糖組大鼠脾臟組織SOD活性顯著增加，MDA含量顯著降低(P<0.01)。見表5。

2.6黃芪多糖對(duì)鎘染毒大鼠血清AST、ALT和LDH的影響 與空白對(duì)照組比較，模型組大鼠血清AST、ALT、LDH活性均顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，黃芪多糖組大鼠血清AST、ALT、LDH活性均顯著降低(P<0.05或P<0.01)。見表6。

表3 各組NK細(xì)胞殺傷活性比較

與空白對(duì)照組比較:1)P<0.05，2)P<0.01；與模型組比較:3)P<0.05，4)P<0.01

表4 各組脾臟IL-2和TGF-β1含量比較

與空白對(duì)照組比較:1)P<0.01；與模型組比較:2)P<0.05，3)P<0.01，表6同

表5 各組脾臟SOD活性和MDA含量比較

與空白對(duì)照組比較:1)P<0.01；與模型組比較:2)P<0.01

表6 各組AST活性、ALT活性和LDH 活性比較

3 討 論

鎘是一種銀白色有光澤的重金屬，有延展性和韌性，廣泛存在于自然界中。鎘可通過(guò)水、食物、密切接觸等多種途徑進(jìn)入機(jī)體，其工業(yè)生產(chǎn)所造成的環(huán)境污染通過(guò)食物鏈進(jìn)入體內(nèi)為主要途徑。鎘對(duì)腎、肺、肝、睪丸、腦、骨骼及血液系統(tǒng)均可產(chǎn)生毒性，被美國(guó)毒物管理委員會(huì)列為第6位危及人體健康的有毒物質(zhì)。有研究顯示〔9〕，鎘不但能與SOD 中的二價(jià)金屬離子發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)性替代作用，抑制 SOD的活力，也能夠促進(jìn)體內(nèi)自由基的產(chǎn)生而不斷消耗SOD。同時(shí)，鎘也可與體內(nèi)含有巰基的抗氧化物及抗氧化酶結(jié)合，從而導(dǎo)致脂質(zhì)過(guò)氧化作用增強(qiáng)〔10〕。黃芪作為甘肅的道地藥材，其根入藥，味甘、性溫，有補(bǔ)氣益氣、補(bǔ)氣升陽(yáng)、固表止汗、托毒排膿等功效。黃芪的活性成分黃芪多糖具有增強(qiáng)和調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能、抗氧化、抗疲勞、抗腫瘤等作用〔11～15〕。

胸腺與脾臟是機(jī)體重要的免疫器官，其結(jié)構(gòu)正常與否直接影響機(jī)體的免疫功能，胸腺指數(shù)與脾臟指數(shù)的高低變化可以反映機(jī)體的免疫功能狀態(tài)〔16〕。而淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)和NK細(xì)胞殺傷實(shí)驗(yàn)則是另外一種反映機(jī)體的細(xì)胞免疫功能和非特異性免疫功能的常用指標(biāo)〔17〕。此外，IL-2和TGF-β1在免疫功能的調(diào)節(jié)上屬于一對(duì)截然相反的指標(biāo)。IL-2是機(jī)體正向免疫調(diào)節(jié)中最重要的細(xì)胞因子之一，主要由T淋巴細(xì)胞分泌，其功能是促進(jìn)T、B淋巴細(xì)胞的增殖〔18〕。 TGF-β1 可能是免疫系統(tǒng)關(guān)閉的信號(hào)之一，其可以抑制所有淋巴細(xì)胞的增殖與功能〔19〕。

本研究結(jié)果提示黃芪可能是通過(guò)抑制鎘致大鼠體內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，增強(qiáng)其機(jī)體的抗氧化能力，進(jìn)而降低機(jī)體的氧化應(yīng)激水平來(lái)減輕鎘對(duì)機(jī)體造成的損傷。同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明，鎘染毒之后，機(jī)體的免疫功能受損，黃芪總苷可能是通過(guò)調(diào)節(jié)機(jī)體免疫增強(qiáng)因子IL-2和免疫抑制因子TGF-β1的含量，從而糾正和改善機(jī)體的細(xì)胞免疫功能和非特異性免疫功能。因此，鎘中毒可以引發(fā)機(jī)體氧化和抗氧化之間的動(dòng)態(tài)失衡，也可以引發(fā)機(jī)體發(fā)生免疫功能紊亂。而黃芪的機(jī)制可能通過(guò)提高機(jī)體的抗氧化能力，增強(qiáng)機(jī)體的免疫力，最終達(dá)到拮抗鎘毒性的目的，但其具體機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。