周靜 曾艷 楊柳 張莉 羅來敏 魏昕 王瑜 李秋月 程斌

(1南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院腎內(nèi)科，江西 南昌 330006；2浙江醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校)

慶大霉素是一種氨基多糖體的抗生素，主要用來對(duì)抗革蘭陰性菌的感染；然而，在臨床上常會(huì)產(chǎn)生腎毒性等副作用。氧化性壓力可能與慶大霉素造成的腎毒性有關(guān)〔1～3〕。蠶蛹油脂中含有大量不飽和脂肪酸甘油酯，在體內(nèi)能水解為人體必需的油酸、亞油酸及亞麻酸等不飽和脂肪酸。蠶蛹油具有增加生物膜液體性、舒張血管、抗血栓形成、降低血漿總膽固醇、抗血小板聚集等藥理作用。本研究主要探討蠶蛹油對(duì)慶大霉素引起大鼠腎臟傷害的保護(hù)作用。

1 材料與試劑

1.1動(dòng)物 SD大鼠70只，雌雄過半，體重(200±50)g，由浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)0012051。飼養(yǎng)室溫控制在25℃，相對(duì)濕度為75%；每只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物自由飲水，喂飼普通飼料。

1.2實(shí)驗(yàn)試劑及儀器 蠶蛹油(江蘇南通福爾生物)；慶大霉素(福建古田藥業(yè))；尿素氮(BUN)、肌酐(CREA)試劑盒(寧波美康)；丙二醛(MDA)-586測(cè)定試劑盒(美國(guó)OXIS)；甲醇(Merck)；鹽酸(Merck)；乙醚(Merck)；格里斯試劑(Griess reagent,Sigma)；乙二胺四乙酸(EDTA)；羥吲哚βD葡萄糖苷酸(indoxyl βD-glucuronide,Sigma)；3-氨基苯二甲酰肼(luminol,Sigma)；硝酸雙-N-甲基吖啶翁(Lucigenin,Sigma)；Tris-HCl(Merck) 。

DRII-CHEM 3500s血液生化分析儀(日本Fujifilm)；CX21BIM-SET6光學(xué)顯微鏡(奧林巴斯)；CLA-2100高效能化學(xué)發(fā)光分析儀(日本Tohoku)；Micro21/21R離心機(jī)(美國(guó)Thermo)；ESB-500室高剪切均質(zhì)乳化機(jī)(上海易勒機(jī)電)；G9雙光束紫外可見分光光度計(jì)(美國(guó)菲勒)。

1.3方法

1.3.1動(dòng)物分組及給藥 70只SD大鼠分成7組，每組10只。第1組為正常組，大鼠每天按照1 ml/kg皮下注射去離子水，同時(shí)按照1 ml/kg灌胃給予去離子水，連續(xù)1 w。第2組為模型組，大鼠每天按照100 mg/kg皮下注射慶大霉素，連續(xù)1 w。第3～7組為給藥組，大鼠每天按100 mg/kg皮下注射慶大霉素，同時(shí)灌胃給予0、1、2、4、8 ml/kg劑量的蠶蛹油，連續(xù)1 w。

1.3.2指標(biāo)檢測(cè) 給藥末日當(dāng)晚禁食不禁水12 h，次日上午，各組大鼠乙醚麻醉后，從股靜脈抽取1.5 ml血液并放入血清分離管中，靜置30 min，4℃ 12 000 r/min離心10 min，取上層血清。采血后，迅速取出腎臟，生理鹽水清洗后，立刻在室溫下浸泡在4%的甲醛中固定，供腎組織病理學(xué)檢查用。

1.3.2.1血生化指標(biāo) BUN及CREA為腎功能的評(píng)估指標(biāo)，采用全自動(dòng)血液生化分析儀進(jìn)行分析。

1.3.2.2腎臟脂質(zhì)過氧化檢測(cè) 取約200 mg腎臟，0.9%生理鹽水沖洗，加Tris-HCl緩沖液(20 mmol/L，pH7.4)進(jìn)行均質(zhì)化，4℃ 12 000 r/min離心30 min。吸取200 μl上層液，按MDA-586測(cè)定試劑盒說明書進(jìn)行MDA含量分析，586 nm波長(zhǎng)處測(cè)量其吸光值。

1.3.2.3腎臟中羥自由基、過氧亞硝酸鹽及超氧陰離子含量測(cè)定 取約200 mg大鼠腎臟，加入Tris-sucrose緩沖液(0.25 mol/L蔗糖溶液加入到含1 mmol/L EDTA的20 mmol/L Tris-HCl緩沖液中，pH7.4)進(jìn)行均質(zhì)，4℃ 12 000 r/min離心30 min。取400 μl 上清液與 200 μl 生理鹽水混合后置入化學(xué)發(fā)光分析儀中分析，分別注入17 mmol/L indoxyl βD-glucurinide和luminol各100 μl，測(cè)量羥自由基、過氧亞硝酸鹽及超氧陰離子含量，用化學(xué)發(fā)光分析儀數(shù)據(jù)采集軟件(CLA-DAS) 計(jì)算待測(cè)樣品含量。

1.3.2.4腎臟中一氧化氮(NO)含量測(cè)定 取約200 mg大鼠腎臟，加去離子水進(jìn)行均質(zhì)，4℃ 12 000 r/min離心30 min；取100 μl 組織上清液與100 μl Greiss reagent(40 mg/ml)混合，然后加入800 μl 的去離子水；550 nm波長(zhǎng)處測(cè)量該樣品之吸光值，計(jì)算NO含量。

1.3.2.5腎臟病理檢測(cè) 將固定好的腎組織HE染色后，在光學(xué)顯微鏡下觀察腎組織病理情況，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：細(xì)胞浸潤(rùn)得1分、喪失邊緣絨毛得1分、細(xì)胞質(zhì)空泡化得1分、細(xì)胞腫脹得1分、細(xì)胞壞死得2分。 至少觀察10個(gè)視野以客觀紀(jì)錄組織傷害嚴(yán)重程度。根據(jù)上述評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)計(jì)分，得分越高表示傷害程度越高。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件行ANOVA分析。

2 結(jié) 果

2.1各組血生化指標(biāo)水平比較 與正常組相比，模型組的血清BUN及CREA水平顯著升高(P<0.05)；與模型組相比，蠶蛹油2～8 ml·kg-1·d-1能顯著降低血清BUN及CREA水平(P<0.05)。見表1。

2.2各組腎臟脂質(zhì)過氧化水平比較 與正常組相比，模型組的腎臟MDA水平顯著升高(P<0.05)；與模型組相比，蠶蛹油2～4 ml·kg-1·d-1能顯著降低腎臟MDA水平(P<0.05)。見表1。

2.3各組腎臟中羥自由基含量測(cè)定 與正常組相比，模型組腎臟中羥自由基的含量顯著升高(P<0.05)；與模型組相比，蠶蛹油2～8 ml·kg-1·d-1能顯著降低腎臟中羥自由基的含量(P<0.05)。見表1。

2.4腎臟中過氧亞硝酸鹽含量測(cè)定 與正常組相比，模型組腎臟中過氧亞硝酸鹽的含量顯著升高(P<0.05)；與模型組相比，蠶蛹油2～8 ml·kg-1·d-1能顯著降低腎臟中過氧亞硝酸鹽的含量(P<0.05)。見表1。

2.5腎臟中超氧陰離子和NO含量測(cè)定 與正常組相比，模型組腎臟中超氧陰離子和NO的含量顯著升高(P<0.05)；與模型組相比，蠶蛹油2～8 ml·kg-1·d-1能顯著降低腎臟中超氧陰離子含量，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。蠶蛹油2～8 ml·kg-1·d-1雖然能降低腎臟中NO的含量，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

2.6腎臟病理檢測(cè) 腎組織病理切片結(jié)果顯示，慶大霉素會(huì)造成大鼠腎臟中腎小管的壞死，而腎小球沒有任何異常。正常組大鼠腎臟中呈現(xiàn)較完整的腎小管形態(tài)，模型組大鼠可以明顯找到腎小管的病變區(qū)域(箭頭處)，而各劑量蠶蛹油給藥組沒有顯著的腎小管病變。將損害程度給予評(píng)分之后，給予蠶蛹油2～8 ml·kg-1·d-1處理，其得分均顯著低于模型組(P<0.05)，表示蠶蛹油能夠有效降低慶大霉素造成的大鼠腎臟組織損傷。見表1和圖1。

表1 各組血BUN、CREA水平及腎臟MDA、羥自由基、過氧亞硝酸鹽、超氧陰離子、NO含量及腎組織病理評(píng)分比較

與正常組比較:1)P<0.05；與模型組比較:2)P<0.05

Ⅰ：正常組；Ⅱ：模型組；Ⅳ～Ⅶ：蠶蛹油1、2、4、8 ml·kg-1·d-1組圖1 蠶蛹油對(duì)各組大鼠腎組織病理的影響(×400)

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)探討了蠶蛹油對(duì)慶大霉素致腎臟傷害的保護(hù)作用，結(jié)果顯示，每天給予一定劑量的蠶蛹油可減緩慶大霉素造成的腎臟傷害。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，蠶蛹油能減少腎臟中羥自由基、過氧亞硝酸鹽、超氧陰離子及一氧化氮的生成。羥自由基及過氧亞硝酸鹽在脂質(zhì)過氧化反應(yīng)及器官衰竭中扮演相當(dāng)重要的角色〔4，5〕。羥自由基會(huì)攻擊多元不飽和脂肪酸，使細(xì)胞產(chǎn)生氧化連鎖反應(yīng)，是造成氧化性傷害的重要物質(zhì)。羥自由基及過氧亞硝酸鹽可能是慶大霉素引發(fā)氧化性傷害的關(guān)鍵因子；又由于羥自由基可以借由過氧亞硝酸鹽分解而來，所以，推測(cè)蠶蛹油也可因?yàn)橐种七^氧亞硝酸鹽的形成，進(jìn)而降低脂質(zhì)過氧化反應(yīng)。而過氧亞硝酸鹽又是由超氧陰離子及NO不斷反應(yīng)所產(chǎn)生〔6〕,所以蠶蛹油也可能因?yàn)橐种芅O及超氧陰離子生成，進(jìn)而減少過氧亞硝酸鹽含量。

本研究發(fā)現(xiàn)，灌食大鼠低劑量的蠶蛹油(2、4 ml·kg-1·d-1)能產(chǎn)生明顯的抗氧化作用，而高劑量的蠶蛹油(8 ml·kg-1·d-1)作用不明顯。蠶蛹油含有極豐富的多元不飽和脂肪酸，雖然多項(xiàng)研究表明多元不飽和脂肪酸是構(gòu)成細(xì)胞膜及維持身體功能的主要物質(zhì)之一〔7〕，可以調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)并具有抗炎作用〔8〕，然而多元不飽和脂肪酸本身也是最容易被自由基攻擊而產(chǎn)生過氧化反應(yīng)的物質(zhì)〔9〕；且經(jīng)過研究證實(shí)，體內(nèi)累積太多多元不飽和脂肪酸可能會(huì)增加氧化性壓力〔10，11〕。因此，當(dāng)大鼠經(jīng)慶大霉素誘導(dǎo)而產(chǎn)生氧化性壓力時(shí)，灌食高劑量的蠶蛹油，其中多元不飽和脂肪酸也是受到氧化性攻擊的主要目標(biāo)物質(zhì)。所以，體內(nèi)累積過多的多元不飽和脂肪酸，反而會(huì)增加脂質(zhì)過氧化反應(yīng)。因此，蠶蛹油的使用并不是越多越好，在安全劑量下使用蠶蛹油才能有效降低氧化壓力，進(jìn)而減緩腎臟的傷害，大量使用并不會(huì)帶來更好的效果。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果為臨床上使用蠶蛹油提供了參考的劑量，故建議臨床使用時(shí)劑量應(yīng)設(shè)定閾值。