蘇振宇 黃建成 董彥博 李小兵 張會軍

(河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院心外科，河北 石家莊 050031)

心肌缺血再灌注后損傷的具體發(fā)病機(jī)制還不明確，是多種因素相互作用的結(jié)果〔1，2〕。減少心肌細(xì)胞內(nèi)鈣超載是防治再灌注損傷的重要環(huán)節(jié)，Ca2+也是調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞收縮和舒張所必需的因素，心肌細(xì)胞內(nèi)游離鈣濃度〔(Ca2+)i〕維持在一定范圍方能保證心肌正常功能〔3〕。成熟心肌〔(Ca2+)i〕主要靠肌漿網(wǎng)的釋放與隔離作用來調(diào)節(jié)。而未成熟心肌的肌漿網(wǎng)稀疏、質(zhì)膜面積和細(xì)胞容積比值大，鈣泵活性低〔4，5〕。為此在心肌缺血再灌注后中使用鈣通道阻斷劑使細(xì)胞外鈣內(nèi)流減少，可減輕細(xì)胞內(nèi)鈣超載，對心肌有保護(hù)作用〔6，7〕。鈣激活氯通道(CaCCS)在組織中分布廣泛，包括血細(xì)胞、上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞中，可參與腺體和上皮分泌、感覺傳導(dǎo)、細(xì)胞增殖、神經(jīng)和心肌興奮性調(diào)節(jié)、細(xì)胞分裂周期等〔8，9〕?？缒さ鞍?TMEM)16A為鈣激活氯通道的分子基礎(chǔ)，在腫瘤組織中明顯表達(dá)上調(diào)〔10，11〕，但是對心肌酶的影響還無相關(guān)報道。本文探討TMEM16A氯通道對心肌缺血再灌注后損傷大鼠乳酸脫氫酶(LDH)和肌酸激酶同工酶(CK-MB)的影響。

1 材料與方法

1.1動物與試劑 出生1～3 d的SD大鼠20只，由河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院動物實驗中心提供。MEM培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶購自Gibco公司，辣根過氧化物酶山羊抗兔IgG購自華美生物工程有限公司，羊抗兔一抗〔蛋白激酶B(Akt)、β-actin等〕購自Cell Signaling公司，LDH和CK-MB檢測試劑盒購自Sigma公司。

1.2心肌細(xì)胞分離與培養(yǎng) SD大鼠消毒，開胸取出心臟，放入預(yù)冷無菌的D-Hank液中，用無菌剪刀剪開心臟，采用D-Hank液沖洗血液。再采用無菌剪刀將心室肌剪成1 mm3大小的組織塊，加入胰蛋白酶消化5～10 min，取上層混懸液。繼續(xù)加入新鮮的胰蛋白酶10 ml消化5～10 min，移棄上清。加入含15%胎牛血清的MEM培養(yǎng)基10 ml，4℃下離心(1 000 r/min，離心半徑10 cm)，過200目孔徑不銹鋼進(jìn)行網(wǎng)篩。心肌細(xì)胞培養(yǎng)鑒定標(biāo)準(zhǔn)：倒置顯微鏡下細(xì)胞呈放射狀，細(xì)胞核呈橢圓形，細(xì)胞呈片狀有節(jié)律搏動。

1.3實驗分組 心肌細(xì)胞分為4組，A組：陰性對照組：于常氧條件下培養(yǎng)心肌細(xì)胞3 h；B組：陽性對照組：灌注組，心肌細(xì)胞未經(jīng)任何處理，采用缺氧2 h、復(fù)氧1 h進(jìn)行心肌缺血再灌注處理。C組：激活組，采用TMEM16A氯通道激活劑1 mmol/L預(yù)處理20 min，再進(jìn)行心肌缺血再灌注處理；D組：抑制組，采用TMEM16A氯通道抑制劑1 mmol/L預(yù)處理20 min，再進(jìn)行心肌缺血再灌注處理。

1.4檢測指標(biāo) (1)細(xì)胞活性測定：將心肌細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板，吸棄培養(yǎng)基，每孔加入5 mg/ml 3-(4,5-二甲基噻唑)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)20 μl，培養(yǎng)4 h后棄MTT液，每孔加入二甲基亞砜100 μl，震蕩20 min后，選擇結(jié)晶紫溶解后，于490 nm下檢測吸光度值，計算細(xì)胞活性。(2)活性氧(ROS)水平測定：心肌細(xì)胞接種于6孔板，加入100 μl終濃度為10 μmol/L的二氯熒光黃雙乙酸鹽(DCFH-CA)覆蓋細(xì)胞，然后與DCFH-CA探針混合，37℃度培養(yǎng)30 min，PBS洗滌3次，采用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞內(nèi)的熒光強(qiáng)度，檢測波長520 nm，熒光強(qiáng)度與細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的ROS量呈正比。(3)Western印跡法：分析活化型半胱天冬酶(cleaved caspase)-3、磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)、Akt的表達(dá)水平，實驗結(jié)束后，倒掉培養(yǎng)液，PBS洗滌細(xì)胞2次，取細(xì)胞，至EP管中，離心(12 000 r/min，4℃)5 min，將上清轉(zhuǎn)移至另一EP管中作為蛋白原樣，進(jìn)行Western印跡分析。讀取目的條帶的光密度掃描值，以β-actin條帶作為內(nèi)標(biāo)，取相對表達(dá)量。(4)CK-MB活性、LDH活性測定：CK-MB活性(U/ml)=〔7.449 1×(測定OD-測定空白OD)-0.071 6〕×樣本測試前稀釋倍數(shù)。LDH活性(U/L)=(OD測定管-OD對照管)/(OD標(biāo)準(zhǔn)管-OD空白管)/50%×反應(yīng)液的總體積，所有實驗重復(fù)3次。

1.5統(tǒng)計方法 采用SPSS22.00軟件行方差分析、t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1心肌細(xì)胞特性 心肌細(xì)胞剛接種后細(xì)胞呈球形懸浮在培養(yǎng)液中；培養(yǎng)4～6 h后開始貼壁生長；培養(yǎng)12～24 h細(xì)胞基本貼壁，自發(fā)性搏動頻率為(40～80)次/min；培養(yǎng)2 d后細(xì)胞收縮明顯而有力，同步節(jié)律性搏動頻率為(90～120)次/min。

2.2細(xì)胞存活率、CK-MB與LDH活性對比 實驗前各組細(xì)胞存活率均在95%以上，實驗結(jié)束后A、B、C、D組的細(xì)胞存活率對比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。B、C、D組的CK-MB與LDH活性都高于A組(P<0.05)，D組的CK-MB與LDH活性低于B組、C組(P<0.05)。見表1。

表1 4組細(xì)胞存活率、CK-MB與LDH 活性對比

與A組對比：1)P<0.05；與B組對比：2)P<0.05；與C組對比：3)P<0.05，下表同

2.3ROS水平對比 B、C組的ROS水平(121.43±18.4、188.93±32.91)顯著高于A組(20.48±3.20，P<0.05)，D組的ROS水平(43.20±2.22)與B、C組相比顯著減少(P<0.05)，但是與A組相比依然有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。

2.4cleaved caspase-3、p-Akt、Akt表達(dá)對比 B、C組的cleaved caspase-3、p-Akt相對表達(dá)水平高于A組(P<0.05)，D組與A組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，4組Akt相對表達(dá)水平對比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖1，表2。

圖1 各組細(xì)胞cleaved caspase-3、p-Akt、Akt表達(dá)

組別cleaved caspase-3p-AktAktAkt/p-AktA組0.45±0.140.10±0.040.78±0.217.84±2.42B組0.63±0.121)0.37±0.121)0.76±0.172.19±0.421)C組0.78±0.311)2)0.58±0.141)2)0.78±0.191.45±0.321)2)D組0.53±0.082)3)0.08±0.032)3)0.77±0.5310.87±3.222)3)F值4.78311.5210.2318.142P值<0.05<0.05>0.05<0.05

3 討 論

從機(jī)制上分析，心肌缺血時，心肌得不到氧及底物供應(yīng)，可造成心肌形態(tài)結(jié)構(gòu)、功能的急劇變化，為此需要迅速恢復(fù)缺血組織的血供，但是長時間缺血的心肌恢復(fù)灌流時組織損傷及器官功能障礙反而加重〔12，13〕。已有研究表明心肌缺血再灌注后損傷與氧自由基、血管無復(fù)流、鈣超載、白細(xì)胞等多種因素，也不是單一因素造成的，而是許多環(huán)節(jié)共同作用的結(jié)果〔14〕。

基礎(chǔ)研究表明TMEM16A沉默能引起內(nèi)源性CaCCs功能的抑制，表達(dá)異源的TMEM16A有CaCCs生理和藥理學(xué)特征，獨(dú)立構(gòu)成了CaCCs或與其他未知蛋白共同構(gòu)成了CaCCs〔15〕。TMEM16A氯通道在正常情況基本處于關(guān)閉狀態(tài)，當(dāng)細(xì)胞缺氧、三磷酸腺苷(ATP)減少時促進(jìn)氯通道開放，TMEM16A氯通道開放可以發(fā)揮加重心肌缺血再灌注損傷的作用，阻斷TMEM16A氯通道則心肌缺血預(yù)適應(yīng)的保護(hù)作用恢復(fù)〔16〕。有研究表明TMEM16A氯通道屬于終末效應(yīng)器〔17〕，但有學(xué)者認(rèn)為TMEM16A氯通道是啟動因子〔18〕。心肌缺血再灌注時，大量的ROS呈現(xiàn)爆發(fā)性生成，從而造成ROS在體內(nèi)積聚。ROS可以使大量的白細(xì)胞在心肌毛細(xì)血管聚集并活化，增強(qiáng)中性粒細(xì)胞的趨化性，引起心肌微血管的阻塞。TMEM16A氯通道抑制劑可有利于降低ROS活動，對心肌缺血再灌注后損傷有良好的防治作用〔19，20〕。

心肌缺血再灌注后損傷后，多種內(nèi)源性物質(zhì)釋放，如降鈣素基因相關(guān)肽、內(nèi)皮素、內(nèi)啡肽等通過相應(yīng)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，引起離子通道改變，但是具體機(jī)制還不明確。最近研究表明TMEM16A氯通道對心肌產(chǎn)生保護(hù)作用，已在培養(yǎng)的大鼠及人心房心肌細(xì)胞得到證實〔21〕。LDH和CK-MB為反映心肌功能的常見指標(biāo)，在診斷再灌注后損傷時有一定價值〔22〕。LDH和CK-MB高表達(dá)可直接損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞，使其通透性增高，破壞血凝-抗血凝平衡，促進(jìn)血栓形成〔23〕。LDH和CK-MB還可刺激血管平滑肌細(xì)胞向血管內(nèi)皮下浸潤、聚集和增生，使血管平滑肌細(xì)胞收縮較弱，肌動蛋白合成減少，從而促進(jìn)動脈粥樣硬化形成〔24〕?；A(chǔ)研究表明CaCCs可激活導(dǎo)致膜去極化或復(fù)極化，鈣調(diào)蛋白的敏感性異常，使鈣通道磷酸化時間延長，導(dǎo)致蛋白磷酸酶活性顯著下降，導(dǎo)致鈣內(nèi)流增加，也誘導(dǎo)了TMEM16A氯通道開放〔25〕。TMEM16A氯通道抑制劑可抑制電位依賴的Ca2+內(nèi)流，擴(kuò)張全身阻力血管和容量血管，從而抑制CK-MB與LDH活性，舒張小冠狀動脈和阻力血管，增加冠狀動脈血流，降低心臟前后負(fù)荷和心肌耗氧量。

心肌缺血再灌注后損傷的調(diào)節(jié)過程涉及多條細(xì)胞內(nèi)外信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路〔26〕。活化的cleaved caspase-3被上游的凋亡始動子激活后可以作用于特異性底物，可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。cleaved caspase-3激活后與可裂解一系列細(xì)胞內(nèi)骨架蛋白及細(xì)胞修復(fù)酶等，改變細(xì)胞結(jié)構(gòu)，激活核酸內(nèi)切酶將染色質(zhì)切割，使細(xì)胞骨架蛋白、細(xì)胞外基質(zhì)蛋白降解，裂解或失活DNA修復(fù)相關(guān)分子〔27〕。本研究表明TMEM16A氯通道抑制劑可通過降低cleaved caspase-3、p-Akt水平從而對再灌注后心肌損傷起到保護(hù)作用。也有研究表明TMEM16A氯通道關(guān)閉能導(dǎo)致細(xì)胞膜超級化和動作電位時間縮短與鈣內(nèi)流降低有關(guān)，并能保護(hù)心肌于缺血時鈣超載所致的不可逆損害〔28〕。