陳榮生 王長(zhǎng)昇 張立群 許衛(wèi)紅

(福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院脊柱外科，福建 福州 350005)

脊髓損傷(SCI)是一種嚴(yán)重的中樞神經(jīng)系統(tǒng)創(chuàng)傷性疾病，可造成永久性、毀滅性的神經(jīng)功能缺損和殘疾。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)是來源于骨髓支持結(jié)構(gòu)的一種多能干細(xì)胞，可在體外定向分化為神經(jīng)元及膠質(zhì)細(xì)胞，用于SCI的移植治療〔1〕，但在神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子與軸突生長(zhǎng)抑制因子相互拮抗的局部環(huán)境中，神經(jīng)再生十分有限〔2〕。腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(hBDNF)在SCI發(fā)生時(shí)表達(dá)上調(diào)，可促進(jìn)SCI中軸突的再生及感覺功能的恢復(fù)〔3，4〕。少突膠質(zhì)細(xì)胞髓鞘糖蛋白(OMgp)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)髓鞘中重要的軸突生長(zhǎng)抑制因子〔5〕，但目前其在BMSCs治療中的意義尚不明確。本研究通過靜脈移植腺病毒上調(diào)hBDNF的BMSCs治療大鼠SCI模型，觀察其療效及對(duì)OMgp表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及細(xì)胞 雄性SD大鼠(上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)構(gòu)建SCI模型，體重(250±20)g。人腎上皮細(xì)胞系HEK293細(xì)胞(上海酶研生物科技有限公司)。

1.2實(shí)驗(yàn)試劑 DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清及胰蛋白酶(美國(guó)Gibco公司)，脂質(zhì)體Lipofectamine2000(美國(guó)Thermo公司)，聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA)蛋白濃度測(cè)定試劑盒(上海碧云天生物公司)，聚偏氟乙烯(PVDF)膜(美國(guó)Millipore公司)，蛋白抽提試劑盒(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司)，電化學(xué)發(fā)光(ECL)發(fā)光液(美國(guó)Thermo公司)，hBDNF、OMgp及β-actin抗體(美國(guó)Abcam公司)，山羊抗兔免疫球蛋白(Ig)G(北京中杉公司)，聚丙烯酰胺，SDS及過硫氨酸等(美國(guó)Arfleresco公司)，其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3實(shí)驗(yàn)儀器 3111型CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo公司)，ECO1.5紫外超凈工作臺(tái)(美國(guó)Thermo公司)，Allegra TM64R高速冷凍離心機(jī)(美國(guó)Beckman公司)，低溫冰箱(德國(guó)Bosch公司)，電泳儀、電泳槽、轉(zhuǎn)印夾及GelDoc XR凝膠成像儀(美國(guó)Bio-Rad公司)，IX70型熒光倒置相差顯微鏡(日本Olympus公司)，DV530紫外分光光度儀(美國(guó)Beckman公司)，微量移液器(法國(guó)JSON公司)，T100細(xì)胞計(jì)數(shù)儀(美國(guó)Bio-Rad公司)，RM6280多道生理信號(hào)采集處理系統(tǒng)(成都儀器廠)。

1.4hBDNF基因修飾大鼠BMSCs的獲取及鑒定 提取、分離、培養(yǎng)、擴(kuò)增并鑒定BMSCs，以hBDNF基因?yàn)槟康幕?，以增?qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)基因?yàn)闃?biāo)志基因的5型復(fù)制缺陷型重組腺病毒載體(Ad5-hBDNF-EGFP)的構(gòu)建及鑒定，具體操作流程見參考文獻(xiàn)〔6〕，利用脂質(zhì)體Lipofectamine2000介導(dǎo)骨架質(zhì)粒pBHGlox-E1-3Cre和穿梭質(zhì)粒pDC316-hBDNF-mCMV-EGFP或EGFP空白載體轉(zhuǎn)入HEK293細(xì)胞中，并收集病毒懸液。取兩組病毒懸液分別以200 MOI濃度感染BMSCs細(xì)胞，感染3 d后觀察熒光強(qiáng)度并進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.5SCI大鼠模型的構(gòu)建及分組 將18只SD大鼠隨機(jī)分為hBDNF-EGFP-BMSCs靜脈移植組(A組)、空白載體-EGFP-BMSCs靜脈移植組(B組)及損傷對(duì)照組(C組)，均采用改良Allen重物打擊法制作T10節(jié)段脊髓損傷模型，具體操作方法見參考文獻(xiàn)〔7〕。建模完成3 d后，將hBDNF-EGFP-BMSCs及空白載體-EGFP-BMSCs兩組細(xì)胞0.25%胰蛋白酶消化，10%胎牛血清+DMEM重懸終止消化，室溫1 000 r/min離心5 min，1 ml磷酸鹽緩沖液(PBS)洗細(xì)胞3次，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為1 × 106個(gè)/ml，A、B、C組分別經(jīng)大鼠尾靜脈注射移植 hBDNF-EGFP-BMSCs、空白載體-EGFP-BMSCs細(xì)胞懸液及0.1 mol/L PBS各1 ml。

1.6Western印跡檢測(cè)細(xì)胞或組織中蛋白表達(dá) 細(xì)胞總蛋白的收集：將hBDNF-EGFP-BMSCs及空白載體-EGFP-BMSCs細(xì)胞培養(yǎng)于25 cm2培養(yǎng)瓶中，待細(xì)胞融合度>80%時(shí)，0.25%胰蛋白酶消化，10%胎牛血清+DMEM重懸終止消化，4℃ 1 000 r/min離心5 min，1 ml PBS洗細(xì)胞3次，200 μl蛋白裂解液及蛋白酶抑制劑4℃處理細(xì)胞1 h，4℃，15 000 r/min離心10 min，取細(xì)胞上清液。組織總蛋白的收集：取靜脈移植5 w后大鼠損傷區(qū)脊髓40 mg，在液氮中研磨成粉末，200 μl蛋白裂解液及蛋白酶抑制劑4℃處理細(xì)胞1 h，4℃，15 000 r/min離心10 min，收集上清液。BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒檢測(cè)總蛋白濃度，取50 μg總蛋白進(jìn)行10%聚丙烯酰胺凝膠電泳，100 V穩(wěn)壓跑至分離膠底部，將PVDF膜及凝膠固定于轉(zhuǎn)印夾中，200 mA轉(zhuǎn)膜2 h，剪取目的條帶，5%脫脂牛奶封閉2 h，將膜與hBDNF(孵育濃度1∶500)、OMgp(孵育濃度1∶500)及β-actin(孵育濃度1∶1 000)抗體4℃脫色搖床孵育過夜，PBS-T洗滌3次，每次10 min，二抗(孵育濃度1∶500)室溫孵育1 h，PBS-T洗滌3次，每次10 min，ECL發(fā)光液孵育1 min，GelDoc XR凝膠成像儀進(jìn)行曝光顯影，目的條帶灰度掃描值與內(nèi)參基因灰度值比值表示hBDNF及OMgp的相對(duì)表達(dá)量。

1.7大鼠后肢運(yùn)動(dòng)功能檢測(cè) 在大鼠靜脈移植后24 h、1、3及5 w，依據(jù)參考文獻(xiàn)〔8〕中提出的大鼠SCI后功能評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)〔脊髓損傷的行為學(xué)(BBB)評(píng)分〕評(píng)價(jià)大鼠后肢運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)情況，評(píng)判時(shí)將大鼠置于直徑1 m的平面光滑場(chǎng)地自由活動(dòng)，觀察并記錄大鼠在5 min內(nèi)前后肢運(yùn)動(dòng)情況，并進(jìn)行評(píng)分。

1.8大鼠皮層體感誘發(fā)電位(CSEP)的檢測(cè) 在大鼠靜脈移植后24 h、1、3及5 w，10%水合氯醛腹腔麻醉，牙科鉆于冠狀線旁下3 mm處開一直徑為3 mm的圓孔暴露硬腦膜，stoelting腦立體定位儀固定大鼠頭部，將銀球微電極經(jīng)圓孔接觸硬腦膜，銀針參考電極置于切開皮膚邊緣，刺激電極安放于手術(shù)區(qū)對(duì)側(cè)坐骨神經(jīng)行徑上，行電脈沖刺激，刺激參數(shù)：強(qiáng)度7.5 V，頻率50 Hz，波寬0.2 ms的單方波，平均疊加100次；分析參數(shù)：時(shí)間常數(shù)0.02 s，靈敏度200 μV，濾波頻率100 Hz。RM6280多道生理信號(hào)采集處理系統(tǒng)行CSEP檢測(cè)。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS16.0進(jìn)行t檢驗(yàn)、方差分析及SNK-q檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1hBDNF-EGFP-BMSCs及空白載體-EGFP-BMSCs細(xì)胞hBDNF及熒光表達(dá)情況 hBDNF-EGFP-BMSCs細(xì)胞中hBDNF相對(duì)表達(dá)量(0.516±0.072)顯著高于空白載體-EGFP-BMSCs細(xì)胞(0.149±0.030，t=8.150，P<0.001)，兩組細(xì)胞均表達(dá)較明顯的綠色熒光，見圖1，圖2。

圖1 hBDNF-EGFP-BMSCs及空白載體-EGFP-BMSCs 細(xì)胞hBDNF表達(dá)情況

圖2 hBDNF-EGFP-BMSCs及空白載體-EGFP-BMSCs 細(xì)胞熒光表達(dá)情況(×63)

2.2各組不同時(shí)期BBB評(píng)分比較 3組第3、5周BBB評(píng)分差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=15.81，17.85；P=0.004 1，0.003 0)，A、B組第3、5周時(shí)BBB評(píng)分顯著高于C組(q=7.767，5.336；均P<0.05)，第5周A組顯著高于B組(q=3.712，P<0.05)，見表1。

表1 各組不同時(shí)期BBB評(píng)分比較分,n=6)

與C組比較：1)P<0.05；與B組比較：2)P<0.05；下表同

2.3各組第5周CSEP潛伏期值及峰值比較 3組第5周CSEP潛伏期比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=21.95，P=0.001 7)，A、B組顯著短于C組(q=9.366,4.901,均P<0.05)，且A組顯著少于B組(q=4.465，P<0.05)；3組第5周峰值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=53.32，P=0.000 2)，A、B組顯著高于C組(q=14.580，6.525；均P<0.05)，且A組顯著高于B組(q=8.052，P<0.05)，見表2。

表2 各組第5周CSEP潛伏期及峰值比較分,n=6)

2.4各組第5周損傷區(qū)脊髓組織hBDNF及OMgp表達(dá) 3組第5周損傷區(qū)脊髓組織hBNF、OMgp表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=23.52，81.25；P=0.001 4，P<0.000 1)。A組hBDNF表達(dá)顯著高于B組及C組(q=8.125，8.650，P<0.05)；A組OMgp表達(dá)顯著低于B組及C組(q=8.183，18.000，均P<0.05)，且B組顯著低于C組(q=9.820，P<0.05)，見圖3，表3。

圖3 大鼠第5周損傷區(qū)脊髓組織hBDNF及 OMgp表達(dá)

組別hBDNF表達(dá)(μg)OMgp表達(dá)(mg)A組0.631±0.0891)2)0.124±0.0201)2)B組0.318±0.0520.374±0.0451)C組0.293±0.0470.672±0.083

3 討 論

目前SCI的治療主要目標(biāo)是減少繼發(fā)性損傷，改善SCI局部微環(huán)境，挽救受損的脊髓神經(jīng)元；利用各種手段和方法促進(jìn)神經(jīng)再生和整合，實(shí)現(xiàn)脊髓結(jié)構(gòu)性恢復(fù)與功能重建。SCI局部微環(huán)境是影響受損神經(jīng)軸突的再生及功能恢復(fù)的重要因素，故目前促進(jìn)脊髓功能恢復(fù)的主要策略包括：①利用神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子促進(jìn)軸突的存活與再生；②應(yīng)用下游信號(hào)分子促進(jìn)軸突的再生；③降低神經(jīng)突觸抑制性分子表達(dá)；④BMSCs移植。BMSCs是來源于骨髓支持結(jié)構(gòu)的一種具有多向分化潛能的多能干細(xì)胞，具有取材方便，培養(yǎng)簡(jiǎn)單，無免疫排斥反應(yīng)等優(yōu)勢(shì)，因此是SCI細(xì)胞替代治療的理想載體〔9，10〕。行BMSCs移植治療后，SCI局部及移植的細(xì)胞可以分泌多種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，但同時(shí)又產(chǎn)生抑制軸突生長(zhǎng)的因子，兩種因子的相互對(duì)抗，導(dǎo)致了有限的神經(jīng)再生〔11〕。要進(jìn)一步促進(jìn)神經(jīng)再生，需要額外補(bǔ)充有促進(jìn)作用的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子。基因治療可將神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子基因?qū)塍w內(nèi)，通過在局部長(zhǎng)期產(chǎn)生神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子提高局部濃度，促進(jìn)SCI的恢復(fù)。hBDNF是一種重要的感覺和運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元營(yíng)養(yǎng)因子，不僅在脊髓的發(fā)育過程及維持脊髓正常生理結(jié)構(gòu)和功能中起重要作用，而且在脊髓原發(fā)性及繼發(fā)性損傷的恢復(fù)中也發(fā)揮重要作用，是脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元強(qiáng)有力的生存因子，可促進(jìn)SCI中軸突的再生及感覺功能的恢復(fù)〔12，13〕。

本研究結(jié)果提示BMSCs移植對(duì)于SCI大鼠神經(jīng)功能修復(fù)具有明顯的促進(jìn)作用，hBDNF的修飾可在BMSCs基礎(chǔ)上進(jìn)一步促進(jìn)SCI大鼠神經(jīng)功能修復(fù)，其機(jī)制可能與增強(qiáng)神經(jīng)元生存及促進(jìn)軸突的再生有關(guān)。另外，BMSCs可有效促進(jìn)大鼠神經(jīng)電生理的恢復(fù)，且經(jīng)過hBDNF修飾可上調(diào)該作用，進(jìn)一步說明了hBDNF對(duì)神經(jīng)修復(fù)的促進(jìn)作用。OMgp是中樞神經(jīng)系統(tǒng)白質(zhì)內(nèi)多肽合成的特異性糖蛋白，大約只占髓磷脂蛋白0.05%，位于髓鞘及少突膠質(zhì)細(xì)胞的外表面〔14〕，作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)髓鞘中的一種重要軸突抑制成分，已經(jīng)被證明能夠抑制軸突生長(zhǎng)，導(dǎo)致生長(zhǎng)錐的塌陷〔15〕。本研究結(jié)果提示BMSCs本身可能存在某種機(jī)制抑制OMgp表達(dá)，且hBDNF可協(xié)同該機(jī)制對(duì)OMgp表達(dá)的抑制，進(jìn)而促進(jìn)神經(jīng)元生存及軸突再生。綜上所述，經(jīng)hBDNF修飾的BMSCs可通過抑制OMgp的表達(dá)促進(jìn)SCI大鼠神經(jīng)功能的恢復(fù)，是有效的治療手段。