黎飚 李海 陳建海 楊潔 梁倩 方曉燕

(右江民族醫(yī)學(xué)院，廣西 百色 533000)

絕經(jīng)后卵巢功能下降導(dǎo)致雌激素水平降低，從而引起骨質(zhì)流失加快，引起絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松(PMOP)，PMOP是老年骨質(zhì)疏松發(fā)病最高、臨床癥狀最重一種。其發(fā)病機制與雌激素分泌減少，護骨素水平下降有關(guān)〔1～3〕。已有研究證實，雌激素受體(ER)基因多態(tài)性與PMOP有關(guān)〔4,5〕，但廣西壯族絕經(jīng)婦女ER-β基因多態(tài)性與血清護骨素水平未見報道。本文主要了解廣西壯族絕經(jīng)后婦女ER-β基因多態(tài)性對其血清護骨素的影響。

1 對象和方法

1.1研究對象 本研究選取祖宗三代均為純壯族廣西絕經(jīng)婦女667人，并排除肝、心、肺和骨科疾病，近期也未用影響骨代謝激素和其他藥品,年齡40～80歲。

1.2骨密度(BMD)檢測 采用超聲跟骨骨質(zhì)密度儀(QUS)測量BMD。由同一特訓(xùn)、熟練的骨質(zhì)密度儀操作人員測定。 酶聯(lián)免疫吸附試驗測定血清護骨素。

1.3ER基因多態(tài)性檢測

1.3.1引物設(shè)計與合成 按照相關(guān)文獻進行設(shè)計引物〔3〕， ER-β基因擴增Rsa I位點：上游引物是：5'-TCTTGCTTTCCCCAGGCTTT-3'，下游引物為：5'-ACCTGTCCAGAACAAGATCT-3'。ER-β基因擴增AluI位點：P1：5'-TTTTTGTCCCCATAGTAACA-3'， P2：5'-AATGAGGGACCACAGCA-3'。

1.3.2提取DNA模板 用碘化鈉(NaI)法。取100 μl抗凝全血加入雙蒸水無菌100 μl，并搖混勻，加NaI (6 mol/L) 200 μl震蕩30 s，再加等體積異戊醇/三氯甲烷(1∶24)震蕩30 s，離心分離上清液，在上清液里加異丙醇混(1∶0.6)渦旋混勻， 4℃放置15 min，離心并取沉淀物，再用70%乙醇洗滌沉淀物1次，晾干沉淀物并溶于三羥甲基氨基甲烷鹽酸(Tris-Hcl)+乙二胺四乙酸(EDTA)溶液中， DNA提取物用紫外分光光度計定量，放置-20℃低溫冰箱待測。

1.3.3PCR擴增 內(nèi)含10×緩沖液200 μmol/L和脫氧核苷酸(dNTPs)200 μmol/L的反應(yīng)體系為50 μl，0.4 μmol/L的引物，0.1 μg的模板DNA。把反應(yīng)體、引物和DNA模板一起置于日本產(chǎn)熱循環(huán)儀(Bio-Rad型)中，經(jīng)95℃預(yù)變性5 min后加入3 U 的TaqDNA聚合酶。反復(fù)32次循環(huán)，再94℃變性30 s，61℃退火60 s，再在72℃條件下延伸90 s，最后一次循環(huán)后，再經(jīng)72℃10 min最后延伸。取其10 μl產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳儀進行電泳，染色(用溴乙啶)后，在紫外燈下檢測結(jié)果和特異性。

1.3.4酶切擴增物 取限切酶Rsa I 10 U，限切酶AluI 20 U和擴增產(chǎn)物10 μl共置于37℃酶切3 h。反應(yīng)最終產(chǎn)物經(jīng)過2%瓊脂糖凝膠電泳，溴乙啶染色30 min，DNA分子量標(biāo)志參照物為參考，電泳結(jié)果在紫外燈下觀察。

1.4統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SSPS18.0軟件進行t檢驗，例數(shù)用直接計數(shù)法。

2 結(jié) 果

2.1ER-β 基因型分析 ER基因多態(tài)性:使用Rsa I酶切可區(qū)分出3 種基因型：Rr 型(158 bp，126 bp大小的2條帶)；RR 型(126 bp大小的1條帶)，rr 型(158 bp大小的1條帶)。見圖1。使用Alu I酶進行酶切可以區(qū)分出3 種基因型：aa型(310 bp大小的1條帶)，Aa 型(310 bp，236 bp，68 bp 大小的3條帶)，AA 型(238 bp，68 bp大小的 2條帶)。見圖2。

M:標(biāo)志參照物；1:Rr 基因型；2:RR 基因型；3:rr 基因型圖1 ER-β基因Rsa I多態(tài)性電泳圖

M:標(biāo)志參照物；1:aa基因型；2:Aa 基因型；3:AA 基因型圖2 ER-β基因Alu I酶切多態(tài)性電泳圖

2.2ER-β基因Rsa I多態(tài)性與跟骨超聲BMD測定結(jié)果 廣西壯族絕經(jīng)婦女各個ER-β 基因Rsa I 酶切基因組的右跟骨BMD隨著年齡增大逐漸減小，60歲之前的ER-β 基因Rsa I 酶切基因5個基因(RR,Rr,rr ，r,R),各個年齡組的BMD差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，而60歲之后的ER-β 基因Rsa I 酶切基因的r基因與同年齡組其他4個基因(RR,Rr,rr，R)組比較， BMD明顯降低(P<0.05)，見表1。

2.3ER-β基因RasⅠ多態(tài)性與血清護骨素測定結(jié)果 廣西壯族絕經(jīng)婦女各個ER-β 基因Rsa I 酶切基因組的血清護骨素水平60歲后隨著年齡增大護骨素水平逐漸減小，60歲之前的ER-β 基因Alu I酶切基因5個基因(RR,Rr,rr，r,R)同年齡組的血清護骨素水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，而60歲之后的ER-β 基因Rsa I 酶切基因的r基因與同年齡組其他4個基因組(RR,Rr,rr，r,R)比較，血清護骨素水平明顯降低(P<0.05)，見表2。

2.4ER-β 基因Alu I 多態(tài)性與跟骨超聲BMD測定結(jié)果 廣西壯族絕經(jīng)婦女各個ER-β 基因Alu I 酶切基因組的右跟骨BMD 45歲后隨著年齡增大BMD逐漸減小，65歲之前的ER-β 基因Alu I 酶切基因5個基因(AA,Aa,aa，a,A),各個年齡組的BMD差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，而65歲之后的ER-β 基因Alu I 酶切基因的aa基因與同年齡組其他4個基因組(AA,Aa,a,A)比較， BMD明顯提高(P<0.05)，見表3。

表1 ER-β基因Rsa I多態(tài)性與不同年齡段BMD測定結(jié)果

與r基因型比較：1)P<0.05；表2同

表2 ER-β基因Rsa I多態(tài)性與不同年齡段護骨素測定結(jié)果

表3 ER-β基因Alu I多態(tài)性與不同年齡段跟骨超聲BMD測定結(jié)果

與aa基因型比較：1)P<0.05；表4同

2.5ER-β 基因Alu I 多態(tài)性與血清護骨素測定結(jié)果 廣西壯族絕經(jīng)婦女各個ER-β 基因Alu I 酶切基因組血清護骨素55歲后隨著年齡增大逐漸減小，65歲之前ER-β 基因Alu I 酶切基因,5個基因(AA,Aa,aa，a,A),各個年齡組護骨素差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，而65歲之后ER-β 基因Alu I酶切基因的aa基因與同年齡組其他4個基因組(AA,Aa,a,A)比較， 護骨素明顯提高(P<0.05)，見表4。

表4 ER-β 基因Alu I 多態(tài)性與不同年齡段護骨素測定結(jié)果

3 討 論

臨床流行病學(xué)研究表明骨質(zhì)疏松與遺傳密切相關(guān)〔6,7〕，研究已發(fā)現(xiàn)ER-β 基因多態(tài)性與絕經(jīng)婦女血清雌二醇水平有關(guān)〔8〕。研究表明雌激素增加破骨細(xì)胞的溶骨功能，抑制成骨細(xì)胞成骨功能，導(dǎo)致骨質(zhì)流失增加〔9,10〕。雌激素是通過與ER結(jié)合發(fā)揮其生理效應(yīng)的，自然ER基因多態(tài)性會影響絕經(jīng)婦女的BMD，所以ER基因多態(tài)性與PMOP密切相關(guān)〔11〕。護骨素與核因子-κB 受體活化因子(RANK)配體結(jié)合阻斷破骨細(xì)胞激活信息通道：核因子-κB 受體活化因子與RANK配體(RANKL)的結(jié)合，從而抑制溶骨，拮抗骨質(zhì)疏松〔12〕。本研究結(jié)果說明ER-β的Rsa I各個 酶切基因?qū)^經(jīng)婦女早期的護骨素和BMD沒有明顯影響，而絕經(jīng)晚期ER-β的Rsa I酶切的r等位基因絕經(jīng)婦女的護骨素水平下降，破骨細(xì)胞功能亢進，導(dǎo)致骨質(zhì)流失加快，BMD降低。ER-β的Rsa I酶切的r等位基因的廣西壯族絕經(jīng)婦女更易患PMOP，應(yīng)該提前做好骨質(zhì)疏松防治。ER-β 的Alu I 酶切基因?qū)^經(jīng)婦女早期的護骨素沒有明顯影響，而絕經(jīng)晚期ER-β 的Alu I 酶切的aa等位基因婦女的護骨素水平提高，破骨細(xì)胞功能被抑制，成骨功能強于破骨功能，BMD得以提高。aa等位基因廣西壯族絕經(jīng)婦女不易患PMOP。

綜上，對引起絕經(jīng)婦女護骨素和BMD下降的易患PMOP的ER-β基因人群提前做好防治工作，可以減少PMOP發(fā)病，可以大大減輕社會和家庭經(jīng)濟負(fù)擔(dān)。