興成娟 陳素賢 李倫 萬義增

(1錦州醫(yī)科大學，遼寧 錦州 121000；2錦州醫(yī)科大學附屬第三醫(yī)院病理科)

結(jié)直腸癌早期無明顯癥狀，大多數(shù)患者發(fā)現(xiàn)時已是中晚期，其治療主要以外科手術(shù)為主，輔以放化療，但效果往往不盡如人意。微衛(wèi)星不穩(wěn)定性(MSI)是結(jié)直腸癌的發(fā)病機制之一，大約占15%散發(fā)性結(jié)直腸癌的發(fā)病病因〔1〕。MSI由錯配修復基蛋白(MMR)缺失造成。目前，主要應(yīng)用于臨床檢測的MMR蛋白包括MLH1、MSH2、MSH6、PMS2。高遷移率族蛋白(HMGA)2是近年發(fā)現(xiàn)的與腫瘤發(fā)生、浸潤、轉(zhuǎn)移有密切關(guān)系的DNA結(jié)合蛋白，在多種惡性腫瘤細胞中均有表達〔2〕。本文探討HMGA2與MSI的相關(guān)性及與結(jié)直腸癌患者臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1研究對象 取自2015年9月至2016年12月錦州醫(yī)科大學附屬第三醫(yī)院病理科結(jié)直腸癌手術(shù)新鮮標本及對應(yīng)常規(guī)石蠟70例，年齡46～72歲，平均59歲，配對正常腸黏膜(距癌5 cm以上)新鮮組織及對應(yīng)常規(guī)石蠟20例。均經(jīng)病理學診斷給予證實。研究對象具有完整病例，均為原發(fā)腫瘤，術(shù)前未經(jīng)抗腫瘤治療。

1.2主要試劑 兔抗人HMGA2多抗購自英國Abcam公司；即用型鼠抗MLH1、MSH2、MSH6和PMS2單抗均購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司；免疫組化二抗pv9000試劑盒、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色劑試劑盒均購自北京中杉生物技術(shù)有限公司；RAPI組織裂解液、聚偏氟乙烯(PVDF)膜、二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測定試劑盒均購自北京索萊寶科技有限公司；Western印跡其他相關(guān)試劑購自碧云天生物技術(shù)研究所。

1.3方法

1.3.1免疫組化 HMGA2一抗稀釋濃度為1∶200，抗原修復液使用pH8.0 EDTA，磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗做陰性對照，乳腺癌組織作陽性對照，實驗步驟按照說明書操作。結(jié)果判定：雙盲法由兩位病理醫(yī)師根據(jù)陽性細胞染色強度及陽性細胞占所有細胞百分比乘積雙向評估，HMGA2細胞核無染色0分，淺黃色1分，棕黃色2分，棕褐色3分，陽性細胞百分比≤5%為0，6%～25%為1，26%～50%為2，51%～75%為3，>75%為4，乘積0為陰性，1～3為弱陽性表達，4～8為中等陽性表達，9～12為強陽性表達〔3〕。無表達和弱陽性表達歸為弱表達，中等陽性及強陽性表達歸為強表達。MSI結(jié)果判斷：MLH1、MSH2、MSH6和PMS2均以腫瘤細胞核部分或全部出現(xiàn)棕黃色染色為陽性表達，若MLH1、MSH2、MSH6和PMS2均為陽性表達，則判定為微衛(wèi)星穩(wěn)定(MSS)，若其中任何一個指標陰性表達，則判定為低頻微衛(wèi)星不穩(wěn)定(MSI-L)，若其中任何≥2個指標陰性表達，則判定為高頻微衛(wèi)星不穩(wěn)定(MSI-H)，腸癌組織做陽性對照。

1.3.2Western印跡法 以總蛋白提取試劑盒說明為準在新鮮標本中提取總蛋白，BCA法定量，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)電泳，PVDF轉(zhuǎn)膜，HMGA2一抗稀釋濃度1∶2 000，增強化學發(fā)光法(ECL)顯影，Image J軟件對條帶進行灰度分析，β-肌動蛋白(β-actin)為內(nèi)參，重復試驗三次，計算蛋白表達水平。

1.4統(tǒng)計學分析 采用SPSS17.0軟件進行χ2檢驗、方差分析或t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1免疫組化結(jié)果

2.1.1HMGA2在結(jié)直腸癌組織和正常腸黏膜組織中的表達 HMGA2陽性表達主要位于細胞核內(nèi)，呈現(xiàn)棕黃色或棕褐色細顆粒狀染色，見圖1。HMGA2在70例結(jié)直腸癌組織中的陽性率為65.71%(46/70)，而在20例正常腸黏膜組織中不表達或弱表達，兩組比較差異顯著(χ2=26.883，P=0.000)。

圖1 HMGA2在正常腸黏膜與結(jié)直腸癌組織的表達(DAB，×200)

2.1.2HMGA2在結(jié)直腸癌中的表達與臨床病理參數(shù)間的關(guān)系 HMGA2的表達與腫瘤分化程度和患者遠處轉(zhuǎn)移有關(guān)。在高、中、低分化癌組織中HMGA2的陽性率差異有統(tǒng)計學意義(P=0.039)；發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移的HMGA2的表達率與無遠處轉(zhuǎn)移的表達率差異有統(tǒng)計學意義(P=0.007)，見表1。

2.1.3結(jié)直腸癌中MSI的檢測結(jié)果 通過檢測MSI相關(guān)蛋白MLH1、MSH2、MSH6和PMS2的表達，判定為MSI-H組12例，發(fā)生率為17.14%(12/70)，MSI-L組7例，發(fā)生率為10.00%(7/70)，MSS組51例，發(fā)生率為72.86%(51/70)(圖2)。其中年齡46～59歲MSI-H發(fā)生率顯著高于60～72歲(P=0.044)；MSI-H右半結(jié)腸發(fā)生率與左半結(jié)腸發(fā)生率差異有統(tǒng)計學意義(P=0.023)。此外，MSI-H發(fā)生與腫瘤分化高低關(guān)系密切(P=0.016)。見表1。

表1 HMGA2、MSI與結(jié)直腸癌臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系(n)

圖2 MSI相關(guān)蛋白表達(DAB，×200)

2.1.4HMGA2在MSI-H組、MSI-L/MSS組的表達情況 MSI-H組HMGA2陽性率為41.67%(5/12)，MSI-L/MSS HMGA2陽性率為70.68%(41/58)，兩組比較差異無統(tǒng)計學意義(χ2=2.531,P=0.111)。

2.2Western印跡結(jié)果

2.2.1HMGA2蛋白在結(jié)直腸癌組織和正常腸黏膜組織中的表達量 HMGA2蛋白條帶在分子量12 kD處顯影，內(nèi)參β-actin蛋白條帶在分子量43 kD處顯影。經(jīng)軟件統(tǒng)計分析，HMGA2的蛋白表達量在正常腸黏膜和結(jié)直腸癌分別為(0.069±0.025)、(0.447±0.098)，差異顯著(t=-50.297，P<0.001)，見圖3。

圖3 不同分組中HMGA2蛋白的表達量

2.2.2HMGA2蛋白表達量與腫瘤分化及臨床分期的關(guān)系 高分化組、中分化組、低分化組HMGA2的蛋白表達量分別為(0.393±0.079)、(0.444±0.093)、(0.503±0.097)，表達呈上升趨勢，兩兩比較差異均有統(tǒng)計學意義(F=16.571，P<0.05)，見圖4。TNMⅠ+Ⅱ期、Ⅲ+Ⅳ期的表達量分別為(0.442±0.095)、(0.501±0.094)，差異有統(tǒng)計學意義(t=-3.000，P<0.05)，見圖5。

圖4 不同分組中HMGA2蛋白的表達量

圖5 不同分期中HMGA2蛋白的表達量

3 討 論

本實驗結(jié)果提示臨床檢測HMGA2可預測腸黏膜病變情況。通過分析HMGA2與臨床病理資料的相關(guān)關(guān)系，發(fā)現(xiàn)癌組織分化程度越低、臨床分期越晚則HMGA2表達越高，說明HMGA2陽性表達與結(jié)直腸癌惡性程度相關(guān)，提示HMGA2可能參與促進結(jié)直腸癌的發(fā)生及惡性趨勢轉(zhuǎn)變過程。但本研究結(jié)果與前人研究〔4〕結(jié)果存在差異。Wang等〔4〕研究發(fā)現(xiàn)HMGA2僅在發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌組織中差異表達，而與患者年齡、性別、腫瘤分級、位置、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床分期均無關(guān)，與徐廣甍〔3〕、Rizzi等〔5〕報道一致。高小平〔6〕研究表明，結(jié)直腸癌腫瘤浸潤深度越深，分化程度越差及TNM分期越晚，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移則HMGA2表達越高，亦說明HMGA2在結(jié)直腸癌的發(fā)生及進展過程中具有重要的促進作用。各組研究結(jié)果不盡相同的原因可能是樣本來源的地域、種族、腫瘤異質(zhì)性及樣本數(shù)量有所不同而造成差異。

MSI是目前臨床上用于判斷結(jié)直腸癌預后及指導治療的重要指標，多項研究指出MSI結(jié)直腸癌患者存在相對獨特的臨床特征，但報道不一仍存在爭議。本研究結(jié)直腸癌MSI發(fā)生率低于李新霞等〔7〕研究數(shù)據(jù)，其中MSI-H發(fā)生率17.14%，與大量報道的平均值較為接近。Fujiyoshi等〔8〕對2 219例結(jié)直腸癌患者進行研究，發(fā)現(xiàn)MSI-H好發(fā)于女性，近端結(jié)腸多于遠端結(jié)腸，黏液腺癌多較見，與年齡、腫瘤大小、TNM分期均相關(guān)，與Kim等〔9〕研究相似。本實驗顯示，MSI-H好發(fā)生于右半結(jié)腸，與年齡及腫瘤分化程度有關(guān)，與Ismael等〔10〕研究結(jié)果一致。本研究結(jié)果可為臨床個體化、精確化治療提供借鑒。造成實驗結(jié)果不同的原因可能是因為目前MSI的檢測方法沒有統(tǒng)一標準，可采用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)檢測，也可用免疫組化檢測，或是選擇研究對象存在偏倚，從而影響實驗結(jié)果。

錯配修復蛋白缺失及腫瘤細胞中某些基因突變是MSI發(fā)生的重要原因。研究發(fā)現(xiàn)，人類結(jié)直腸癌MSI的發(fā)生與激活轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β/Smads信號通路中的轉(zhuǎn)化生長因子受體關(guān)系密切〔11,12〕。本研究說明HMGA2的表達與微衛(wèi)星狀態(tài)無關(guān)，提示HMGA2可能通過TGF-β/Smads信號通路之外的其他途徑發(fā)揮作用。最近研究表明，HMGA2作為啟動子結(jié)合到白細胞介素(IL)11的-2147/-2132區(qū)域并激活轉(zhuǎn)錄，通過STAT3信號途徑誘導腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移〔13〕，間接證明了我們的觀點。

總之，HMGA2在腫瘤形成及進展中發(fā)揮重要作用，HMGA2及MSI在結(jié)直腸癌中作用及相關(guān)性的研究還處于組織階段，后期將對其進行細胞學研究，對二者的深入研究能為結(jié)直腸癌的發(fā)病機制提供更多的理論基礎(chǔ)，為結(jié)直腸癌的篩查、治療尋找新的標靶。