宋琪， 劉金龍， 郭憲光*

(1.中國科學院成都生物研究所，成都610041； 2. 中國科學院大學，北京100049)

微衛(wèi)星(microsatellite)又稱為簡短串聯(lián)重復(short tandem repeats，STRs)或簡單序列重復(simple sequence repeats，SSRs)，Skinner等(1974)在寄居蟹Paguruspollicaris中發(fā)現(xiàn)微衛(wèi)星DNA序列開啟了對真核生物中微衛(wèi)星序列的了解。直到Powell等(1996)定義了微衛(wèi)星位點，認為微衛(wèi)星DNA序列一般是以1～6個核苷酸為重復單位的串聯(lián)重復序列，在從病毒到真核生物的基因組中均有分布，并且具有高度的長度多態(tài)性(Zaneetal.，2002)。由于微衛(wèi)星突變速率快、多態(tài)性高、分布廣泛、符合孟德爾遺傳、易于檢測等優(yōu)點，被廣泛應用于種群遺傳、譜系地理和親子鑒定等領域。據(jù)Guichoux等(2011)統(tǒng)計，1990—2009年有關微衛(wèi)星的論文數(shù)量增長迅猛。而開發(fā)微衛(wèi)星標記的傳統(tǒng)方法耗時、耗力(Abdelkrimetal.，2009)，采用高通量測序技術獲得微衛(wèi)星序列已發(fā)展為主流方法(曾聰?shù)龋?013；黃杰等，2015；Zhouetal.，2016)。其中，二代測序技術——Roche 454 測序除高效、快捷外，其片段讀長更大，更適合微衛(wèi)星標記的開發(fā)(Allentoftetal.，2009；程曉鳳等，2011)。

葉城沙蜥Phrynocephalusaxillaris隸屬于鬣蜥科Agamidae沙蜥屬Phrynocephalus，是我國特有的一種小型爬行動物，分布于我國新疆天山山脈南部地區(qū)，包括塔里木盆地及周邊的吐魯番-哈密盆地和敦煌盆地(趙爾宓等，1999)。其棲息生境為戈壁、荒漠或沙漠邊緣地帶以及固定沙丘的丘間平地(<3 000 m；趙爾宓等，1999)。有關葉城沙蜥種群遺傳結構，利用線粒體基因數(shù)據(jù)并未得到很好的解析，這可能與其分化時間太短或不完全譜系分選有關(Zhangetal.，2010；李俊，2013)。基于微衛(wèi)星位點變異速率快、多態(tài)性高等特點，有望更全面地解析葉城沙蜥的種群遺傳結構。

葉城沙蜥微衛(wèi)星標記的研究僅見于Nie等(2015)運用轉錄組測序對青海沙蜥P.vlangalii開展的微衛(wèi)星位點開發(fā)，跨物種在葉城沙蜥中檢測到17個可擴增的微衛(wèi)星位點。本研究通過Roche 454 GS FLX高通量測序，對葉城沙蜥基因組進行測序，同時用搜索軟件掃描基因組序列，搜索和輸出其微衛(wèi)星序列。本研究首次對葉城沙蜥核基因組微衛(wèi)星序列進行了初步的統(tǒng)計和分析，旨在對其基因組水平上的微衛(wèi)星重復序列的種類、數(shù)量等進行初步探索，以期為開發(fā)和篩選大量高質量微衛(wèi)星標記提供數(shù)據(jù)支持，也為利用微衛(wèi)星標記研究葉城沙蜥的種群遺傳結構和譜系地理模式奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 樣品收集、基因組DNA提取及Roche 454 GS FLX高通量測序

用于基因組測序的葉城沙蜥標本(標本號：WGXG08226)于2008年6月采于新疆維吾爾自治區(qū)吐魯番沙漠植物園(89.19°E，42.86°N)，經(jīng)75%乙醇固定后，保存于中國科學院成都生物研究所兩棲爬行動物標本館。其肝臟組織樣品固定于95%乙醇中，-20 ℃保存。2013年11月將提取的基因組DNA送上海美吉生物信息科技有限公司，采用基于焦磷酸測序法的高通量基因測序系統(tǒng)——Roche 454 GS FLX進行基因組測序。

1.2 數(shù)據(jù)分析

采用Roche 454 GS FLX系統(tǒng)對測序數(shù)據(jù)進行過濾、整理，使用Newbler 2.6(Roche，2011)對優(yōu)化后的原始數(shù)據(jù)從頭拼裝(denovoassembly)，并將組裝出的contigs和未拼裝的single read序列合并。采用Krait(Duetal.，2018)對合并的總序列進行微衛(wèi)星位點的查找，所使用的搜索標準如下：單堿基重復≥9次，其他堿基重復(二堿基、三堿基、四堿基、五堿基、六堿基)≥5次，其余參數(shù)采用默認設置。

2 結果與分析

2.1 測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計

原始測序數(shù)據(jù)的每條read經(jīng)過質量過濾后，對下機數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計，得到91 190條reads，共47 982 924 bp，最短的27 bp，最長的1 168 bp，平均長度為526.2 bp，主要集中分布在550～750 bp(圖1)。

2.2 基因組組裝

利用Newbler對reads拼接，得到715個contigs，共359 650 bp，最短的100 bp，最長的15 025 bp，平均為503 bp。未拼接上的reads有65 873個，共34 820 132 bp。

2.3 微衛(wèi)星位點分析

將組裝出的contigs和未組裝的single read序列合并，得到合并序列66 588個，共35 179 782 bp。對合并的總序列進行微衛(wèi)星位點分析，獲得微衛(wèi)星重復序列29 890個。重復類型最多的為單堿基重復類型，占總重復類型的48.95%；其次是二堿基重復類型，占28.60%；最少的為六堿基重復類型，僅占0.32%(表1)。

圖1 Roche 454 GS FLX原始數(shù)據(jù)長度分布統(tǒng)計Fig. 1 Distribution of the sequence length for the raw reads data in Roche 454 GS FLX

A～C″代表不同的序列長度范圍 A to C″ means different ranges of sequence length； A. 1～40， B. 41～60， C. 61～80， D. 81～100， E. 101～120， F. 121～140， G. 141～160， H. 161～180， I. 181～200， J. 201～220， K. 221～240， L. 241～260， M. 261～280， N. 281～300， O. 301～320， P. 321～340， Q. 341～360， R. 361～380， S. 381～400， T. 401～420， U. 421～440， V. 441～460， W. 461～480， X. 481～500， Y. 501～520， Z. 521～540， A′. 541～560， B′. 561～580， C′. 581～600， D′. 601～620， E′. 621～640， F′. 641～660， G′. 661～680， H′. 681～700， I′. 701～720， G′. 721～740， K′. 741～760， L′. 761～780， M′. 781～800， N′. 801～820， O′. 821～840， P′. 841～860， Q′. 861～880， R′. 881～900， S′. 901～920， T′. 921～940， U′. 941～960， V′. 961～980， W′. 981～1 000， X′. 1 001～1 020， Y′. 1 021～1 040， Z′. 1 041～1 060， A″. 1 061～1 080， B″. 1 081～1 140， C″. 1 141～1 180

表1 不同重復類型的完美型微衛(wèi)星在葉城沙蜥基因組的分布Table 1 Distribution of perfect microsatellites for different repeat types in the genome of Phrynocephalus axillaris

2.3.1各重復拷貝類型的數(shù)量和相應的比例同一種類型的重復序列中，各重復拷貝類型所占的比例不相同(表2)。二堿基重復類型中，AC重復拷貝類型最多，占二堿基重復序列總數(shù)的54.94%，有4 697個，其次是AG(37.20%)和AT(6.84%)，CG最少，只有87個，占1.02%。三堿基重復類型中，有 9種重復拷貝類型，數(shù)量較多的是ATC和AAT，分別有588個和498個，占三堿基重復序列總數(shù)的18.78%和15.90%，其他類型詳見表2。四堿基重復類型的重復拷貝類型有27種，最多的是AAAT，有1 288個，占四堿基重復序列總數(shù)的40.16%，其次是ATAG，占15.06%，其他類型相對較少，占比均不超過10%。五堿基重復類型中，AAAAT重復拷貝類型最多，有87個，占五堿基重復序列總數(shù)的31.75%；其次是AAAAC(16.42%)、AATAG(5.11%)、AAAAG(4.01%)，其他類型均不超過10個。六堿基重復類型中，最多的是AATCCC，有20個，占六堿基重復序列總數(shù)的20.62%，其他類型均不超過20個。

表2 葉城沙蜥基因組中分布頻率最高的微衛(wèi)星重復類型Table 2 The most frequent microsatellite motifs detected in the genome of Phrynocephalus axillaris

2.3.2各種重復類型微衛(wèi)星拷貝數(shù)的數(shù)量分布二堿基重復為5～186次，主要分布在5～9次，有6 248個，占二堿基重復類型總數(shù)的73.08%；三堿基重復為5～36次，主要分布在5～10次，有2 162個，占三堿基重復類型總數(shù)的69.03%；四堿基重復為5～43次，主要分布在5～14次，共2 625個，占四堿基重復類型總數(shù)的81.85%；五堿基重復為5～11次，共261個，占五堿基重復類型總數(shù)的95.26%；六堿基重復為5～17次，主要分布在5～9次，共87個，占六堿基重復類型總數(shù)的89.69%(圖2)。

數(shù)量最多的前11個完美型微衛(wèi)星重復類型依次是C、A、AC、AG、AAAT、ATC、AT、AAT、ATAG、AGG、AAC，這些微衛(wèi)星在基因組中均出現(xiàn)400次以上，占完美型微衛(wèi)星總數(shù)的89.96%。

圖2 葉城沙蜥不同重復類型微衛(wèi)星拷貝數(shù)的分布Fig. 2 Distribution of the copy number in different microsatellite motifs for Phrynocephalus axillaris

3 討論

由于單堿基重復難以準確測定(Sunetal.，2006)，通常在分析開始就被舍棄(Kimetal.， 2008)。本研究表明，除單堿基重復外的所有重復類型中，二堿基重復最多，這與大熊貓Ailuropodamelanoleuca和北極熊Ursusmaritimus(李午佼等，2014)、褐菖鲉Sebastiscusmarmoratus(Songetal.，2017)和團頭魴Megalobramaamblycephala(曾聰?shù)龋?013)等類似。這可能與微衛(wèi)星序列越長、突變率越高、穩(wěn)定性越差有關(Wierdletal.，1997)。在很多真核生物中，重復長度和重復頻率呈負相關(Kattietal.，2001)。本研究發(fā)現(xiàn)隨拷貝數(shù)增加，重復序列數(shù)量變少，也符合這一整體趨勢。此外，AC重復是葉城沙蜥基因組中二堿基重復中最多的類型，占54.94%，同時也是除單堿基重復外所有重復類型中最多的一類。脊椎動物基因組的30%～67%微衛(wèi)星重復是二堿基重復，而AC重復是最多的一種(Tóthetal.，2000)，本研究結果也支持了此觀點。

表3 分布頻率最高的重復類型微衛(wèi)星的拷貝數(shù)分布Table 3 Distribution of the copy repeats number of the most frequent microsatellite motifs

二代測序出現(xiàn)前，對于非模式生物，微衛(wèi)星重復類型的獲得均是一個瓶頸(Guichouxetal.，2011)。隨著高通量測序技術的發(fā)展，測序成本逐漸降低，可獲得的數(shù)據(jù)越來越多，這為進一步增進對非模式物種的深度了解提供了契機。Nie等(2015)運用高通量測序技術對青海沙蜥進行轉錄組測序，鑒定、篩選出25個微衛(wèi)星位點，其中17個可在葉城沙蜥中擴增；而經(jīng)Bonferroni校正后，其中有9個顯著偏離哈迪-溫伯格平衡(P<0.01)，且這些位點的擴增適用性及多態(tài)性尚未在葉城沙蜥的不同種群中驗證。本研究使用高通量測序技術對葉城沙蜥進行基因組SSR分子標記開發(fā)及分析，并基于Krait(Duetal.，2018)對基因組中完美型微衛(wèi)星進行統(tǒng)計，深化了對葉城沙蜥基因組的認識和了解，并為下一步開發(fā)和篩選大量高質量微衛(wèi)星標記提供數(shù)據(jù)支持，還為利用微衛(wèi)星標記研究葉城沙蜥種群遺傳結構和譜系地理模式奠定了基礎。