向欽， 王會娟， ， 劉陽， 伍悅， 曹敏， 賴國旗， 何明忠*

(1.重慶醫(yī)科大學實驗動物中心，重慶400016； 2. 浙江大學基礎醫(yī)學院，杭州310058；3. 重慶醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院肝膽外科，重慶400010)

銅綠假單胞菌Pseudomonasaeruginosa通常被稱為綠膿桿菌(Silbyetal.，2011)，為臨床上較常見的人獸共患致病菌，在人體的各個部位都可能存在，一般出現(xiàn)在動物的鼻咽部和下消化道。銅綠假單胞菌感染后滲出液等呈綠色，能夠引起化膿性病變，嚴重影響人和動物的健康以及動物實驗的結果(Gordonetal.，1955；蔣觀成，浦野徹，1991；Baker，1998)?？焖?、準確地檢出銅綠假單胞菌，對控制該病原菌的感染具有重要意義。目前，銅綠假單胞菌的檢測方法主要有細菌分離鑒定、免疫學、PCR等。其中，細菌分離鑒定法準確性高，但耗時費力、檢出率低、易漏檢；免疫學法檢測過程繁雜、周期長、靈敏度低(王燕等，2010)；盡管PCR法靈敏度較高，但對儀器設備要求嚴，很難在基層單位推廣應用(Lodengetal.，2006；Deschaghtetal.，2009；Schwartzetal.，2010)。因此，探索準確、高效的銅綠假單胞菌檢測方法，對人和實驗動物感染的預防和控制都極其重要。

環(huán)介導等溫擴增技術(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)(Notomietal.，2000；Yoneyamaetal.，2007)具有操作簡單、結果直觀、特異性強及比普通PCR靈敏度高等突出優(yōu)點，已被廣泛應用于一些病原微生物的檢測(Iwamotoetal.，2003；Horisakaetal.，2004；Songetal.，2005)，包括銅綠假單胞菌(Gotoetal.，2010；Diribeetal.，2015；Kimetal.，2016)。由于LAMP的引物是擴增技術的關鍵所在，不同區(qū)域的引物對目的基因的擴增效果有重要影響。根據(jù)LAMP的基本原理，針對銅綠假單胞菌oprL基因序列的新區(qū)域，設計了相應的LAMP特異性引物，通過優(yōu)化，達到高效、特異、靈敏的結果，并以《GB/T 14926.17-2001 實驗動物 綠膿桿菌檢測方法》和PCR法為對照，通過實驗小鼠血清樣本對建立方法進行驗證，以期為豐富銅綠假單胞菌的檢測手段提供重要依據(jù)。

1 材料

1.1 菌株及實驗動物準備

銅綠假單胞菌(菌株編號：ATCC27853)由重慶市疾病預防控制中心饋贈；甲型副傷寒沙門桿菌SalmonellaparatyphoidA(菌株編號：CMCC50093)、鼠傷寒沙門氏菌Salmonellatyphimurium(菌株編號：CMCC50115)、肺炎克雷伯桿菌Klebsiellapneumoniae(菌株編號：CMCC46117)、嗜肺巴斯德桿菌Pasteurellapneumotropica(菌株編號：ATCC35149)、金黃色葡萄球菌Staphylococcusaureus(菌株編號：ATCC-25923、CMC6003)均由廣東省實驗動物監(jiān)測所饋贈；87只實驗小鼠(24只C57BL/6J小鼠、24只KM小鼠、16只BALB/c小鼠、23只各品系轉(zhuǎn)基因小鼠)及其血清樣本隨機抽取于重慶市實驗動物質(zhì)量檢測中心[實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(渝)2012-0001、-0003、-0005、-0006；實驗動物使用許可證號：SYXK(渝)2012-0001]。

1.2 試劑及儀器

Bst酶3.0購自New England Biolabs；Taq DNA聚合酶、dNTPs、基因組DNA提取試劑盒(DP304)購自天根生化科技(北京)有限公司；NAC(naldixic acid cetrimide)液體/固體培養(yǎng)基購自北京三藥科技開發(fā)有限公司；腸桿菌科細菌編碼(杭州)購自杭州微生物試劑廠；低溫離心機、紫外可見核酸蛋白分析儀Bio Mate 3S購自Thermo Fisher Scientific；LAMP實時濁度儀(LA-320)和擴增試劑盒(4X004)購自日本榮研化學株式會社；SYBR Green Ⅰ購自InvitrogenTMThermo Fisher Scientific；PowerPac3000電泳儀、GelDocXR+凝膠成像分析儀及PCR熱循環(huán)儀(S1000TMThermal Cyclers)購自Bio-Rad(上海)有限公司；恒溫培養(yǎng)振蕩器購自上海智誠分析儀器制造有限公司。

2 方法

2.1 DNA模板準備

NAC固體培養(yǎng)基上接種銅綠假單胞菌菌株，37 ℃培育20 h左右，挑單菌落在相同條件下用NAC液體培養(yǎng)基進行培育。菌液DNA提取步驟為：取菌液12 000 r·min-1離心5 min，加10 mmol·L-1Tris-EDTA(pH7.5)緩沖液50L，100 ℃ 10 min，-20 ℃ 2 min，12 000 r·min-1離心10 min，分離上清，-20 ℃儲存。

2.2 引物設計與合成

根據(jù)銅綠假單胞菌oprL基因序列，在新區(qū)域內(nèi)用PrimerExploer V4分別設計包含內(nèi)引物(FIP、BIP)、外引物(F3、B3c)和環(huán)引物(LFc、LB)在內(nèi)的3對LAMP特異性引物；根據(jù)參考文獻(de Vosetal.，1997；邢進等，2012)合成2套PCR引物[oprL(F1、R1)，16SrRNA(F2、R2)](圖1，表1)，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

圖1 環(huán)介異等溫擴增技術引物在oprL基因的位置(GenBank登錄號： Z50191.1)Fig. 1 The position of loop-mediated isothermal amplification primers in oprL gene (GenBank accession number： Z50191.1)

注： B3c、F1c、B2c、LFc分別為B3、F1、B2、LF的互補序列

Note： B3c, F1c, B2c and LFc are complementary sequence of B3, F1, B2 and LF, respectively

2.3 反應條件優(yōu)化

2.3.1溫度優(yōu)化根據(jù)Bst酶最佳溫度范圍：60～66 ℃，設置8個溫度梯度進行反應：59 ℃、60 ℃、61 ℃、62 ℃、63 ℃、64 ℃、65 ℃、66 ℃。最佳反應溫度判斷標準為：LAMP開始擴增的時間較早、最大擴增效率高且用時較短。

2.3.2內(nèi)引物濃度優(yōu)化設置8個濃度梯度的內(nèi)引物(FIP/BIP)：20 μmol·L-1、30 μmol·L-1、40 μmol·L-1、50 μmol·L-1、60 μmol·L-1、70 μmol·L-1、80 μmol·L-1、90 μmol·L-1(即以40 μmol·L-10.5 μL FIP和40 μmol·L-10.5 μL BIP為起點，按0.25 μL梯度等差遞增體積等量加至2.25 μL)，再分別加入5 μmol·L-1F3/B3c、20 μmol·L-1LFc/LB和Bst酶各1 μL，模板DNA 1 μL，2×RM緩沖液12.5 μL，無酶水補齊25 μL，混勻，在最佳反應溫度下反應。最佳的內(nèi)引物濃度判斷標準為：擴增開始時間較早、最大擴增效率較大且用時較短。

2.3.3環(huán)引物濃度優(yōu)化設置6個濃度梯度的環(huán)引物(LFc/LB)：10 μmol·L-1、15 μmol·L-1、20 μmol·L-1、25 μmol·L-1、30 μmol·L-1、35 μmol·L-1(即以20 μmol·L-10.5 μL LFc和20 μmol·L-10.5 μL LB為起點，按0.25 μL梯度等差遞增體積等量加至1.75 μL)，再分別加入70 μmol·L-1FIP/BIP、5 μmol·L-1F3/B3c、Bst酶各1 μL，2×RM緩沖液11.5 μL，模板DNA 1 μL，無酶水補齊25 μL，混勻，在最佳反應溫度下反應。最佳的環(huán)引物濃度判斷標準為：擴增開始時間較早、最大擴增效率較大且用時較短。

2.4 特異性試驗

按照上述新建立的LAMP體系，檢測其對包括銅綠假單胞菌在內(nèi)的7株菌株(ATCC27853、CMCC50115、CMCC50093、ATCC35149、CMCC46117、ATCC25923、CMC6003)的鑒別能力，樣本擴增后加入1 μL SYBR Green Ⅰ后，使用LAMP實時濁度儀觀察顏色變化，產(chǎn)物1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

2.5 穩(wěn)定性試驗

取6份不同批次銅綠假單胞菌菌液提取DNA，用新建立的LAMP體系進行檢測。

2.6 重復性試驗

取6份同批次銅綠假單胞菌菌液提取的DNA，用新建立的LAMP體系進行檢測。

2.7 靈敏度試驗

紫外可見核酸蛋白分析儀測定菌液DNA濃度，取已知濃度的銅綠假單胞菌DNA，將銅綠假單胞菌DNA起始濃度設為2.9 μg·mL-1，按10倍濃度梯度進行稀釋至10-8或10-9，分別用已建立的LAMP方法及文獻報道的PCR方法(de Vosetal.，1997；邢進等，2012)進行擴增，測定二者對銅綠假單胞菌的檢測限。

2.8 臨床樣本的檢測

隨機抽取重慶市實驗動物檢測中心87只小鼠，每只小鼠同時收集血清及回盲部內(nèi)容物，利用DNA試劑盒提取血清DNA樣本，進行LAMP擴增，隨后每個樣本中加入1 μL SYBR Green Ⅰ觀察顏色變化；同時，按照《GB/T 14926.17-2001 實驗動物 綠膿桿菌檢測方法》檢測，即采取回盲部內(nèi)容物接種NAC液體培養(yǎng)基，置于(36±1) ℃培養(yǎng)18～24 h后觀察生長情況，對未產(chǎn)生綠色色素者轉(zhuǎn)種NAC瓊脂平皿，(36±1) ℃培養(yǎng)18～24 h，對生長特性及菌落特征與銅綠假單胞菌一致的菌落進一步進行生化鑒定；LAMP或《GB/T 14926.17-2001 實驗動物 綠膿桿菌檢測方法》檢測結果為陽性的樣本，進一步用PCR方法驗證。

3 結果

3.1 反應體系的建立

3.1.1溫度優(yōu)化比較8個溫度梯度擴增結果，滿足擴增效率最大且用時最短的溫度為66 ℃，即確定66 ℃為最佳反應溫度(圖2)。

圖2 溫度優(yōu)化Fig. 2 Optimization of temperature

3.1.2內(nèi)引物濃度優(yōu)化在內(nèi)引物濃度為70 μmol·L-1時，反應體系在15 min左右開始擴增，此時的最大擴增效率較高，并且達到最大擴增效率用時相對較短，因此將70 μmol·L-1判定為反應的最佳內(nèi)引物濃度(圖3)。

3.1.3環(huán)引物濃度優(yōu)化在環(huán)引物濃度為30 μmol·L-1時，反應體系在12 min左右開始擴增，此時的最大擴增效率較高，并且達到最大擴增效率用時較短，故將30 μmol·L-1判定為反應的最佳環(huán)引物濃度(圖4)。

圖3 內(nèi)引物濃度優(yōu)化Fig. 3 Optimization of inner primers concentration

A.不同內(nèi)引物濃度下環(huán)介導等溫擴增技術的擴增效率， CH1～CH8為20～90 μmol·L-1的8個內(nèi)引物濃度梯度； B. 不同濃度內(nèi)引物下的擴增時間和最大擴增效率

A.amplification efficiency of loop-mediated isothermal amplification under different concentrations of inner primers， CH1-CH8 indicate different concentration gradients of inner primers from 20 μmol·L-1to 90 μmol·L-1； B. amplification time and maximum amplification rate under different concentrations of inner primers

3.1.4最終反應體系的建立通過優(yōu)化反應條件最終確定：66 ℃為最佳反應溫度，反應體系(25 μL)如下：2×RM緩沖液12.5 μL，70 μmol·L-1FIP、70 μmol·L-1BIP、5 μmol·L-1F3、5 μmol·L-1B3c、30 μmol·L-1LFc、30 μmol·L-1LB、Bst酶和模板DNA各1 μL，無酶水4.5 μL。

3.2 特異性

結果僅顯示銅綠假單胞菌的DNA樣本為陽性(圖5：A)；其余6株菌株(鼠傷寒沙門氏菌、甲型副傷寒沙門桿菌、嗜肺巴斯德桿菌、肺炎克雷伯桿菌、2株金黃色葡萄球菌)的DNA樣本均為陰性。向擴增后的產(chǎn)物中加1 μL SYBR Green Ⅰ觀察顏色，發(fā)現(xiàn)只有銅綠假單胞菌的DNA樣本能看到翠綠色(圖5：B)；瓊脂糖凝膠電泳結果可知僅銅綠假單胞菌DNA樣本擴增出清晰的條帶(圖5：C)。

圖4 環(huán)引物濃度優(yōu)化Fig. 4 Optimization of loop primers concentration

A.不同環(huán)引物濃度下環(huán)介導等溫擴增技術的擴增效率， CH1～CH6為10～35 μmol·L-1的6個環(huán)引物濃度梯度； B. 不同濃度環(huán)引物下的擴增時間和最大擴增效率

A.amplification efficiency of loop-mediated isothermal amplification under different concentrations of loop primers， CH1-CH6 indicate different concentration gradients of loop primers from 10 μmol·L-1to 35 μmol·L-1； B. amplification time and maximum amplification rate under different concentrations of loop primers

3.3 穩(wěn)定性

用新建立的LAMP體系對不同批次不同時間提取的6份DNA檢測結果均為陽性(圖6)，樣品管的擴增效率、濁度之間的差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，表明該檢測方法較穩(wěn)定。

3.4 重復性

用新建立的LAMP體系對6份同批次DNA檢測結果均為陽性，且擴增效率和濁度2條曲線的重合率極高(圖7)，表明該檢測方法的重復性較好。

3.5 靈敏度

梯度稀釋后的銅綠假單胞菌DNA用LAMP和PCR方法檢測，其最低檢測濃度分 別 為 2.9×10-7μg·mL-1(圖8：A～C)和2.9×10-4μg·mL-1(圖8：D、E)。

3.6 臨床樣本檢測

用新建立的LAMP體系擴增87份小鼠血清樣本，有10份顯示為銅綠假單胞菌陽性，檢出率為11.5%(10/87)，擴增產(chǎn)物加入SYBR Green Ⅰ 后，觀察顏色變化(圖9：A)。按照《GB/T 14926.17-2001 實驗動物 綠膿桿菌檢測方法》對同批次87只小鼠回盲部內(nèi)容物進行檢測的結果均為陰性。用PCR方法擴增LAMP檢測的10份陽性樣本DNA，擴增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂凝膠電泳，均在1 519 bp和504 bp處可見陽性條帶(圖9：B、C)。

圖5 環(huán)介導等溫擴增技術(LAMP)檢測的特異性Fig. 5 Specificity of loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assay

A. 不同菌株的LAMP鑒定， B. 熒光鑒定圖， C. 瓊脂糖電泳圖； 1. 銅綠假單胞菌DNA， 2～7分別為鼠傷寒沙門氏菌、甲型副傷寒沙門桿菌、嗜肺巴斯德桿菌、肺炎克雷伯桿菌、金黃色葡萄球菌ATCC25923和CMC6003的DNA， 8. 空白對照， M. DL2000 DNA Marker

A.product identification by LAMP， B. sample fluorescence， C. agarose gel electrophoresis of reaction products； lane 1.PseudomonascaeruginosaDNA product， lanes 2-7.Salmonellatyphimurium，SalmonellaparatyphoidA，Pasteurellapneumotropica，Klebsiellapneumoniae，StaphylococcusaureusATCC25923 and CMC6003 DNA products， 8. control， M. DL2000 DNA Marker

4 討論

與傳統(tǒng)的檢測方法相比，LAMP最大的優(yōu)點在于反應全程均可在恒溫條件下進行，避免了溫度循環(huán)的時間消耗，擴增的反應結果肉眼可見(陽性結果呈白色渾濁)，達到快速檢測的目的，LAMP的引物是擴增技術的關鍵(Notomietal.，2000；Yoneyamaetal.，2007)。本研究根據(jù)銅綠假單胞菌(Z50191)的oprL基因序列針對8個不同區(qū)域所設計的6條特異性引物(Iwamotoetal.，2003；Enomotoetal.，2005；Yamazakietal.，2008)。與GenBank中的銅綠假單胞菌基因序列比對，該引物還包含其他基因序列，如EU28653、JF901474、JN628780、JN628781、JN628782、JN628828、JN717231、KP056547，顯示出了引物的高度保守性和特異性。此外，對溫度、內(nèi)引物濃度、環(huán)引物濃度的梯度進行優(yōu)化，最終確立最優(yōu)方案如下：溫度66 ℃，內(nèi)引物濃度70 μmol·L-1，環(huán)引物濃度30 μmol·L-1。

圖6 環(huán)介導等溫擴增技術(LAMP)檢測的穩(wěn)定性Fig. 6 Stability of loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assay

A. 樣本的鑒定， B. LAMP擴增效率， C. 樣本濁度； 1～6為不同批次不同時間提取的銅綠假單胞菌的DNA樣本， 7、8為空白對照

A.product identification， B. LAMP amplification efficiency， C. sample turbidity； 1-6 indicate the different batches at different times ofPseudomonasaeruginosaDNA product， 7 and 8 represent the negative control

圖7 環(huán)介導等溫擴增技術(LAMP)檢測的重復性Fig. 7 Repeatability of loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assay

A.樣本的鑒定， B. LAMP 擴增效率， C. 樣本濁度； 1～6為同批次的銅綠假單胞菌的DNA樣本， 7為空白對照， 8為空信號通道

A.product identification， B. LAMP amplification efficiency， C. sample turbidity； 1-6 indicate the same batch at different times ofPseudormonasaeruginnosaDNA product， 7 represents the negative control， 8. null

用新建立的LAMP體系分別檢測實驗小鼠體內(nèi)常見的6種病原微生物和不同批次及同一批次的不同時間段的銅綠假單胞菌DNA樣本，結果都顯示了較高的特異性、重復性和穩(wěn)定性；再運用標準銅綠假單胞菌DNA比較新建立的LAMP體系與PCR方法檢測結果的差異，結果表明，新檢測體系能檢出的銅綠假單胞菌最低檢測限為2.9×10-7μg·mL-1，比普通PCR (2.9×10-4μg·mL-1)的靈敏度高出103倍，與已報道方法(Zhaoetal.，2011)(比普通PCR方法高102倍)比較，其靈敏度更高。

為了評價新建立的LAMP方法在實驗動物銅綠假單胞菌檢測中的應用價值，對87份小鼠血清樣本進行了檢測，檢出率為11.5%(10/87)，而利用《GB/T 14926.17-2001 實驗動物 綠膿桿菌檢測方法》的檢出率為0%(0/87)，同時，16SrRNA和oprL利用PCR方法進行陽性樣本驗證時，其結果與LAMP方法檢測結果完全一致(10/10)；實驗結果顯示，LAMP檢測方法比傳統(tǒng)分離培養(yǎng)檢測方法的檢出率高。在檢測手段上，《GB/T 14926.17-2001 實驗動物 綠膿桿菌檢測方法》需要各種不同的培養(yǎng)基(如：NAC液體/固體培養(yǎng)基、普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、糖發(fā)酵培養(yǎng)基等)，還需要肉眼選擇可疑菌落進行生化試驗，檢測時間長，不可控因素也較多。盡管與傳統(tǒng)PCR方法檢測結果一致，但新LAMP檢測體系不需要特殊儀器，操作簡單，非常適合基層單位，能夠有效地應用于人和動物的銅綠假單胞菌檢測，對保證人及動物安全具有重要意義；也為實驗動物銅綠假單胞菌的質(zhì)量控制提供了新的、可靠的檢測方法。

圖8 環(huán)介導等溫擴增技術(LAMP)檢測的靈敏度Fig. 8 Sensitivity of loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assay

A. 樣本的鑒定， 1～8分別為按照100～10-7稀釋的銅綠假單胞菌DNA； B. 樣本的鑒定， 1為稀釋10-8的銅綠假單胞菌DNA， 2為空白對照， 3～8為空信號通道； C. LAMP凝膠電泳圖(M為DL2000 DNA Marker， 2～9分別為按照100～10-8稀釋的銅綠假單胞菌DNA， N為陰性對照)； D. 16SrRNAPCR凝膠電泳圖(M為DL2000 DNA Marker， 2～10分別為按照100～10-9稀釋的銅綠假單胞菌DNA， N為陰性對照)； E.oprLPCR凝膠電泳圖(M為DL2000 DNA Marker， 2～10分別為按照100～10-9稀釋的銅綠假單胞菌DNA， N為陰性對照)

A. product identification， dilutedPseudomonasaeruginosaDNA according to 100-10-7from lanes 1-8； B. product identification， lane 1. diluted 10-8P.aeruginosaDNA， lane 2. control， lane 3-8. null； C. agarose gel electrophoresis of LAMP reaction products (M. DL2000 DNA Marker， lanes 2-9. 10-fold serial dilutions ofP.aeruginosaDNA， lane N. negative control)； D. agarose gel electrophoresis of 16SrRNAPCR amplification (M. DL2000 DNA Marker， lanes 2-10. 10-fold serial dilutions ofP.aeruginosaDNA， lane N. negative control)； E. agarose gel electrophoresis ofoprLPCR amplification (M. DL2000 DNA Marker， lanes 2-10， 10-fold serial dilutions ofP.aeruginosaDNA， lane N. negative control)

圖9 小鼠血清樣本檢測結果
Fig. 9 Detection results of mouse serum samples

A. 環(huán)介異等溫擴增技術反應陽性結果(1～10為陽性樣本)； B. 16SrRNAPCR凝膠電泳圖(M為DL2000 DNA Marker， N為陰性對照)；C.oprLPCR凝膠電泳圖(M為DL2000 DNA Marker， 1～10為陽性樣本， N為陰性對照)

A. fluorescence result of loop-mediated is othermal amplification (lanes 1-10. positive samples)； B. agarose gel electrophoresis of 16SrRNAPCR amplification (M. DL2000 DNA Marker， lanes 1-10. positive samples， lane N. negative control)； C. agarose gel electrophoresis ofoprLPCR amplification (M. DL2000 DNA Marker， lanes 1-10. positive samples， lane N. negative control)