，，，

(1.四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，生物資源與生態(tài)環(huán)境教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 610065；2.四川大學(xué)水力學(xué)與山區(qū)河流開(kāi)發(fā)保護(hù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 610065；3.四川沃爾宜環(huán)保科技有限公司，成都 610000)

許多植物種種皮既不透水，也不能吸脹發(fā)芽，這種保持種子原有大小狀態(tài)的種子被稱為硬實(shí)，是植物的一種休眠形式，是植物種經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期自然選擇，適應(yīng)環(huán)境并維持種的延續(xù)和傳播的一種積極應(yīng)對(duì)策略[1]。豆科、百合科、漆樹(shù)科等植物種子種皮硬實(shí)或種皮蠟質(zhì)化現(xiàn)象普遍，抑制了種子的正常萌發(fā)，如苦豆子、山毛豆、田菁、鹽膚木等。在生產(chǎn)實(shí)踐及科研中往往需要破除植物種子的休眠機(jī)制，掌握種子休眠萌發(fā)規(guī)律和延長(zhǎng)種子壽命[2-3]。有研究證實(shí)，苦豆子和苦馬豆種子硬實(shí)率高達(dá)92%，鹽膚木種子硬實(shí)率高達(dá)90.2%，未經(jīng)任何處理的甘草種子發(fā)芽率不足20%，成熟后的山毛豆自然條件下的萌發(fā)率只有22.5%[4-8]。目前，針對(duì)種子硬實(shí)的破除問(wèn)題，國(guó)內(nèi)外已開(kāi)展了大量研究，破除種子休眠的方法主要包括物理法、化學(xué)法、生物法和綜合法[9-12]。其中，酸處理、熱水浸種、低溫液氮處理已被證實(shí)可有效破除種子休眠，提高硬實(shí)種子的萌發(fā)率。不同植物種子休眠機(jī)制具有特殊性，因此，在實(shí)踐操作中應(yīng)根據(jù)種子的不同采取相對(duì)應(yīng)的處理方法，如改變處理液濃度、溫度、時(shí)長(zhǎng)等。當(dāng)前，熱水浸種法是最實(shí)用，應(yīng)用最廣泛的一種打破種子機(jī)械休眠的方法，與酸處理等化學(xué)浸種法相比，熱水浸種更經(jīng)濟(jì)環(huán)保，特別是針對(duì)種皮、角質(zhì)層較厚，透水、透氣性差的硬實(shí)種子[13]。通過(guò)熱水燙種可以有效軟化種皮，破壞種子表皮堅(jiān)硬的柵欄組織、致密結(jié)構(gòu)，從而增強(qiáng)種皮透水、透氣性，打破硬實(shí)，而且熱水燙種成本較低，污染小，浸種廢液無(wú)需經(jīng)過(guò)處理。在應(yīng)用過(guò)程中，不同的植物種要根據(jù)其硬實(shí)程度、種皮厚度，有針對(duì)性的選擇浸種溫度、浸種時(shí)間。

基于上述內(nèi)容，本研究以9種豆科，2種漆樹(shù)科，1種無(wú)患子科，1種禾本科，1種麻黃科植物種子為研究材料，了解種子硬實(shí)、蠟質(zhì)等對(duì)這14種植物種子萌發(fā)的影響，分析不同溫度、不同時(shí)長(zhǎng)的熱水浸種對(duì)不同植物種子休眠破除的影響，探討不同目標(biāo)植物種子硬實(shí)破除的最優(yōu)處理方法，打破重要目標(biāo)植物種子的機(jī)械休眠，提高種子萌發(fā)率，為后期浸種調(diào)控試驗(yàn)提供基本資料。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)主要是針對(duì)種皮堅(jiān)硬、存在機(jī)械休眠的種子，選擇了14種具有高硬實(shí)度的種子進(jìn)行試驗(yàn)，供試的所有種子均購(gòu)買于2015年10月至2017年3月，詳細(xì)信息見(jiàn)表1。

表1 供試種子詳細(xì)信息

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 種子處理

首先用電子天平稱取一定量的種子，將種子用0.3%的高錳酸鉀溶液消毒20 min，然后用清水沖洗干凈，并用吸水紙吸干表面水分備用。每個(gè)植物種設(shè)置2個(gè)溫度梯度：60，70 ℃；每個(gè)溫度梯度再設(shè)置3個(gè)時(shí)間梯度：10，20，30 min；每個(gè)植物種處理設(shè)2組重復(fù)，所需試件總數(shù)為196個(gè)，具體的浸種溫度、時(shí)間設(shè)置處理見(jiàn)表2。選取50 mL的燒杯，按照梯度設(shè)計(jì)分別貼上標(biāo)簽，每個(gè)燒杯隨機(jī)放入經(jīng)過(guò)消毒的種子100粒，然后將一定溫度(60，70 ℃)的熱水加入燒杯中，加水至50 mL刻度線，分別放入恒溫水浴鍋(60，70 ℃)中恒溫浸種，記錄浸種開(kāi)始時(shí)間。根據(jù)不同浸種時(shí)間設(shè)置，分別在不同時(shí)間將種子從燒杯中取出，然后利用吸水紙將種子表面水分吸干，然后在通風(fēng)干燥處將種子晾干，并用變色硅膠干燥劑進(jìn)行干燥處理，使其干燥至原始含水量備用。

1.2.2試驗(yàn)設(shè)計(jì)

測(cè)定樣品為經(jīng)過(guò)熱水燙種后干燥并經(jīng)過(guò)篩選的純凈種子，按照隨機(jī)原則提取，試驗(yàn)設(shè)計(jì)如表2，不同植物種均隨機(jī)選擇100粒，設(shè)2組重復(fù)。將分取好的種子分別放置到發(fā)芽床上，每粒種子間留下種子直徑2～5倍以上的間距，以防止發(fā)生霉變的種子互相感染，每粒種子應(yīng)該良好的接觸水面，使種子發(fā)芽條件保持一致。在萌發(fā)盤(pán)上貼上標(biāo)簽，注明日期、樣品編號(hào)、品種、處理方法等。將貼好標(biāo)簽的發(fā)芽床置于白天溫度25 ℃(12 h，時(shí)間為07：00—19：00)，夜間溫度20 ℃(12 h，時(shí)間為19：00—07：00)，光照5 000 lx，相對(duì)濕度為60%～70%的人工氣候箱內(nèi)進(jìn)行萌發(fā)試驗(yàn)。試驗(yàn)用水為去離子水，發(fā)芽床始終保持濕潤(rùn)狀態(tài)，加水時(shí)采用滴管沿著發(fā)芽盤(pán)內(nèi)壁多次加入，并每天觀測(cè)水分情況，表面砂子呈干狀立即加水，以濕潤(rùn)但不形成水膜為宜，各重復(fù)間的供水量保持一致。經(jīng)常檢查測(cè)定樣品及其水分、通氣、溫度、光照條件。輕微發(fā)霉的種粒可以揀出用清水沖洗后放回原發(fā)芽床。發(fā)霉種粒較多的(超過(guò)5%)要及時(shí)更換發(fā)芽床或發(fā)芽容器。

1.2.3 觀測(cè)與記錄

種子發(fā)芽試驗(yàn)測(cè)定的持續(xù)時(shí)間自置床之日起，記錄30 d內(nèi)的發(fā)芽數(shù)，如果規(guī)定時(shí)間內(nèi)發(fā)芽的種粒不多，可以適當(dāng)延長(zhǎng)測(cè)定時(shí)間，但最多不超過(guò)規(guī)定時(shí)間的1/2。如果在規(guī)定的時(shí)間結(jié)束之前樣品已經(jīng)充分發(fā)芽，且后期連續(xù)3 d每天發(fā)芽粒數(shù)不超過(guò)重復(fù)供試種子粒數(shù)1%，則該次測(cè)定可以提前結(jié)束。以芽長(zhǎng)超過(guò)種子長(zhǎng)度約1/2，根長(zhǎng)達(dá)種子長(zhǎng)度1/2為發(fā)芽標(biāo)準(zhǔn)，滿足二者其一即可視為發(fā)芽。每2 d觀測(cè)記錄1次發(fā)芽狀況，記錄正常發(fā)芽粒數(shù)與異狀發(fā)芽粒數(shù)，用鑷子將幼苗去除，并進(jìn)行觀測(cè)數(shù)據(jù)記錄。

表2 種子浸種處理的設(shè)置

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用Excel 2007軟件和SPSS 13.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，并計(jì)算發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)，公式如下：

發(fā)芽率(%)=∑n/N×100%；

發(fā)芽勢(shì)(%)=n/N×100%；

發(fā)芽指數(shù)=∑Gt/Dt。

式中，N為供試種子數(shù)，D為從萌發(fā)開(kāi)始的時(shí)間，n為在時(shí)間D的萌發(fā)數(shù)。Gt為與Dt相對(duì)應(yīng)的每天發(fā)芽種子數(shù)，Dt為發(fā)芽時(shí)間[14]。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同熱水處理方式對(duì)種子萌發(fā)率的影響

表3列出了不同熱水處理方式下14種植物種子的萌發(fā)率情況。研究結(jié)果表明，對(duì)照處理下，百喜草、苦豆子、山毛豆、田菁、草麻黃、馬棘、金合歡、銀合歡、黃槐決明、鹽膚木、車桑子、臺(tái)灣相思、任豆、火炬樹(shù)的萌發(fā)率都較低，均不超過(guò)42%，尤其是漆樹(shù)科的鹽膚木和火炬樹(shù)種子基本不萌發(fā)。在進(jìn)行熱水浸種處理后，苦豆子、山毛豆、金合歡、銀合歡、鹽膚木、車桑子、臺(tái)灣相思、任豆和火炬樹(shù)種子的萌發(fā)率由處理前的38%、42%、17%、27.5%、0、8%、18%、12.5%和2%，顯著提高到78%、71%、75%、92.5%、45%、65%、66%、100%和48%。百喜草種子經(jīng)60 ℃熱水處理20 min，70 ℃熱水處理10 min，其發(fā)芽率可達(dá)45%，但與對(duì)照相比無(wú)較大差異，當(dāng)熱水處理時(shí)間為30 min時(shí)，種子萌發(fā)率低至18%。熱水浸種不能打破田菁、馬棘、黃槐決明種子休眠，反而隨著浸種溫度的升高、時(shí)間的延長(zhǎng)，其萌發(fā)率分別由38%、30%、16%降低為10%、7%、13%?？喽棺?、銀合歡、鹽膚木、火炬樹(shù)在70 ℃條件下種子的萌發(fā)率顯著高于60 ℃，但是鹽膚木、火炬樹(shù)種子的最高發(fā)芽率仍然只有約45%、48%，硬實(shí)率仍然較高。

表4 不同溫度熱水處理對(duì)種子發(fā)芽的影響

表3 不同溫度熱水處理下種子萌發(fā)率記錄

2.2 不同熱水處理方式對(duì)種子發(fā)芽勢(shì)及發(fā)芽指數(shù)的影響

表4列出了不同熱水處理方式下14種植物種子的發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽指數(shù)，與發(fā)芽率相比，發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽指數(shù)能夠更加靈敏的表示種子活力。由表4可知，苦豆子、金合歡、銀合歡、鹽膚木、車桑子、臺(tái)灣相思、火炬樹(shù)7種植物種子的發(fā)芽勢(shì)隨浸種溫度的升高、時(shí)間的延長(zhǎng)不斷增大，分別由對(duì)照處理的38%、14%、25%、0%、2%、14%、1%提高到75%、70%、88%、42%、40%、52%、35%，銀合歡60 ℃與70 ℃浸種發(fā)芽勢(shì)差異顯著，60 ℃浸種20 min的發(fā)芽勢(shì)為38%，70 ℃浸種20 min的發(fā)芽勢(shì)顯著提高到88%(p<0.05)，是對(duì)照種子發(fā)芽勢(shì)的3.5倍。百喜草種子60 ℃和70 ℃所有處理下的發(fā)芽勢(shì)均低于對(duì)照處理的27%，黃槐決明種子熱水浸種與對(duì)照處理差異不大，任豆種子60 ℃浸種10 min的發(fā)芽勢(shì)為90%，70 ℃浸種20 min發(fā)芽勢(shì)高(達(dá)100%)。田菁、草麻黃、馬棘種子60 ℃浸種時(shí)，隨著浸種時(shí)間的不斷延長(zhǎng)，發(fā)芽勢(shì)均有所增加，但70℃浸種時(shí)，發(fā)芽勢(shì)急劇下降，分別由對(duì)照的34%、20%、27%下降為4%、5%、6%。

種子的發(fā)芽指數(shù)是表征種子活力的一個(gè)重要指標(biāo)，發(fā)芽指數(shù)越高，證明種子活力越強(qiáng)[15]。苦豆子、山毛豆、金合歡、銀合歡、鹽膚木、車桑子、臺(tái)灣相思、任豆、火炬樹(shù)9種植物種子隨著浸種溫度的升高、時(shí)間的延長(zhǎng)，發(fā)芽指數(shù)明顯高于對(duì)照，分別由對(duì)照的12.96、11.44、3.90、3.00、0、1.10、1.95、1.17、0.27增加到28.08、27.29、19.17、10.59、8.82、9.84、7.33、11.85、8.60，其中車桑子、任豆、火炬樹(shù)與對(duì)照相比，發(fā)芽指數(shù)分別增加了7.9倍、9.1倍、39.9倍，差異顯著(p<0.05)。60 ℃浸種時(shí)，百喜草、田菁、馬棘、黃槐決明種子發(fā)芽指數(shù)略微高于對(duì)照處理，但70 ℃浸種30 min時(shí)，百喜草、田菁、馬棘種子的發(fā)芽指數(shù)分別由對(duì)照的5.38、10.80、6.48下降為2.47、1.39、1.74。草麻黃60 ℃浸種時(shí)，發(fā)芽指數(shù)隨浸種時(shí)間的延長(zhǎng)顯著增大，由對(duì)照的4.03顯著增大到13.11，比對(duì)照提高了2.25倍，但70 ℃浸種時(shí)，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)發(fā)芽指數(shù)逐漸下降為1.26，僅為對(duì)照發(fā)芽指數(shù)的1/3。

表5 不同溫度熱水處理下腐爛種子情況記錄(%)

2.3 不同熱水處理方式對(duì)種子腐爛率的影響

表5列出了試驗(yàn)期間不同處理下腐爛種子的詳細(xì)情況，百喜草、苦豆子、草麻黃、銀合歡、鹽膚木、任豆、火炬樹(shù)種子在所有處理下腐爛率均低于5%，其中百喜草未出現(xiàn)腐爛種子。田菁和黃槐決明種子所有處理下均腐爛嚴(yán)重，對(duì)照處理種子腐爛率分別為22%和34%，70 ℃浸種后腐爛率分別高達(dá)40%和44%。山毛豆、馬棘、金合歡、車桑子、臺(tái)灣相思種子對(duì)照處理腐爛率均低于6%，熱水浸種處理后腐爛率顯著增大，70 ℃浸種30 min后，馬棘種子腐爛率由對(duì)照處理的5%顯著提高到68%(p<0.05)，馬棘種子隨著浸種溫度的升高、時(shí)間的延長(zhǎng)，腐爛率不斷上升；60 ℃浸種10 min后，車桑子、臺(tái)灣相思種子腐爛率由對(duì)照處理的0%、3%分別提高到10%、12%。

3 討 論

熱水浸種操作簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)環(huán)保、效果顯著，在大量育種中有顯著的優(yōu)勢(shì)[16]。試驗(yàn)結(jié)果表明，熱水浸種是打破種子硬實(shí)休眠，促進(jìn)種子萌發(fā)的有效方法，但是部分植物種，如百喜草、田菁、馬棘、黃槐決明的浸種效果不明顯，甚至萌發(fā)率隨著浸種溫度升高、時(shí)間延長(zhǎng)，顯著下降，雖然打破了種子的種皮限制，但是對(duì)種胚損傷嚴(yán)重，導(dǎo)致種子萌發(fā)率下降，腐爛種子數(shù)增多。胡小文等[17]在對(duì)豆科種子休眠破除方法的研究中指出，印度田菁種子在80 ℃的熱水中浸泡3 min發(fā)芽效果最好，發(fā)芽率高達(dá)85%。與本試驗(yàn)研究結(jié)果存在較大的差異，分析造成這種差異的原因可能是供試種子并非同一批次采購(gòu)，貯存時(shí)間、地點(diǎn)與方式均不相同，種子本身硬實(shí)度也存在差異，以上綜合性影響因素均可能造成田菁種子對(duì)熱水浸種不同反應(yīng)機(jī)理；也有可能是本批次采購(gòu)的種子存在質(zhì)量問(wèn)題造成浸種后大批量腐爛種子的出現(xiàn)。60，70 ℃熱水浸種在一定程度上打破了漆樹(shù)科鹽膚木、火炬樹(shù)種子的休眠機(jī)制，但整體發(fā)芽率未超過(guò)48%，可以考慮進(jìn)一步提高浸種溫度或者時(shí)間，若熱水浸種仍無(wú)法提高其萌發(fā)率，需考慮采用其他的化學(xué)、生物等方法。因此，種子在大批量處理前，均應(yīng)按照當(dāng)前條件，重新探尋適宜的處理方法，以免造成不必要的損失。

熱水浸種對(duì)苦豆子、山毛豆、金合歡、銀合歡、車桑子、臺(tái)灣相思、任豆7種植物種子的調(diào)控效果最為顯著?？喽棺印⒔鸷蠚g、銀合歡、臺(tái)灣相思和任豆經(jīng)70 ℃熱水浸種30 min后發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽指數(shù)均達(dá)到試驗(yàn)期間的較大值，萌發(fā)率可達(dá)到78%、75%、90%、66%和100%，分別為對(duì)照萌發(fā)率的2.1倍、4.4倍、3.3倍、3.7倍和8倍。因此熱水燙種是打破苦豆子、金合歡、銀合歡、臺(tái)灣相思和任豆5種植物種子硬實(shí)的有效方法，對(duì)其萌發(fā)具有很好的促進(jìn)作用。陳?？萚18]也在其研究中指出，破除合歡種子硬實(shí)的最優(yōu)方法是70 ℃熱水浸種，與本試驗(yàn)研究結(jié)果一致。本試驗(yàn)60 ℃浸種條件下，隨著燙種時(shí)間延長(zhǎng)，山毛豆種子萌發(fā)率逐漸升高，在60 ℃、30 min條件下，種子萌發(fā)率達(dá)到71%，為對(duì)照的1.7倍。而70 ℃條件下的種子腐爛率升高、萌發(fā)率低至45%，幾乎與對(duì)照的42%無(wú)差異，原因可能是，水溫高于種子的最大承受能力，對(duì)種胚破壞嚴(yán)重，使種子內(nèi)部活性蛋白和酶類失活，種子萌發(fā)能力下降。車桑子種子在70 ℃、10 min浸種條件下，種子發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)、發(fā)芽率均為所有試驗(yàn)處理的最大值，萌發(fā)率最高為65%，為對(duì)照的8倍。因此，為了達(dá)到較好的調(diào)控效果，需要嚴(yán)格控制燙種溫度與時(shí)間。

4 結(jié) 論

通過(guò)對(duì)14種存在機(jī)械休眠的植物種子進(jìn)行熱水浸種處理，得出以下結(jié)論：針對(duì)存在堅(jiān)硬外殼、堅(jiān)硬種皮的硬實(shí)種子，熱水浸種是一個(gè)有效方法，但是不同植物種由于種皮厚度不同，硬實(shí)程度不同，最優(yōu)的處理方法也不相同，因此，需要根據(jù)不同的植物種的特點(diǎn)，確定最優(yōu)的方法，以防溫度過(guò)低無(wú)法破除硬實(shí)或者溫度過(guò)高損傷種胚，導(dǎo)致萌發(fā)率下降。