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(遼寧中醫(yī)藥大學藥學院，遼寧 大連 116600)

穿龍薯蕷(DioscoreanipponicaMakino)為薯蕷科多年生草本植物，分布于我國東北、華北、山東、河南、安徽、浙江北部、江西(廬山)、陜西(秦嶺以北)、甘肅、寧夏、青海南部、四川西北部[1]。以干燥根莖入藥，習稱穿山龍，味甘、苦，性溫[2]，具有祛風除濕，舒筋通絡，活血止痛等作用?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，穿山龍具有明顯的抗炎作用，有較好的開發(fā)前景[3]。隨著穿山龍藥材需求量的不斷增加，其藥材商品的需求量也隨之增多，不同區(qū)域產地間藥材商品質量差異較大等問題也隨之凸顯。原因之一是穿龍薯蕷種子商品質量差異較大。然而關于穿龍薯蕷種子質量等級的劃分標準十分不清晰，很難對市售種子的質量進行有效的控制和評價，造成種子質量良莠不齊，嚴重影響藥材的規(guī)范化生產成效。因此，本研究在對不同產地穿龍薯蕷種子全面收集的基礎上，根據(jù)《農作物種子檢驗規(guī)程》(GB/T 3543-1995)[4]開展穿龍薯蕷種子質量分級標準研究，以期為規(guī)范和制定穿龍薯蕷種子質量標準提供依據(jù)，實現(xiàn)市售種子的規(guī)范化，從源頭控制穿龍薯蕷藥材的質量。

1 材料與儀器

1.1 材 料

穿龍薯蕷種子于2016—2017年收集，共27個批次樣品，分別來源于黑龍江省、吉林省、遼寧省、內蒙古自治區(qū)、甘肅省、青海省、寧夏回族自治區(qū)、陜西省、山西省、山東省、河北省、河南省、安徽省、浙江省、江西省、湖南省、四川省、廣西壯族自治區(qū)。其中，遼寧共8份樣品，分別收集于遼寧省清原縣、遼寧省清原縣英額門鎮(zhèn)丁家街村、遼寧省清原縣英額門鎮(zhèn)椽子溝村、遼寧省清原縣大孤家鎮(zhèn)、遼寧省新賓縣大四平鄉(xiāng)、遼寧省阜新市、遼寧省本溪市、遼寧省鞍山市；吉林省3份樣品，分別收集于吉林省柳河縣三源浦鎮(zhèn)、吉林省梅河口龍山、吉林省梅河縣山城鎮(zhèn)。經遼寧中醫(yī)藥大學尹海波教授鑒定為薯蕷科植物穿龍薯蕷的干燥成熟種子，各種子批產地來源編號見表1。

1.2 儀 器

LRH-150-GIS人工氣候箱(韶關市泰宏醫(yī)療器械有限公司)，DNP-9162型電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海精宏實驗設備有限公司)，電熱鼓風干燥箱(上海一恒科學儀器有限公司)，JD 60-4電子天平(沈陽龍騰電子有限公司)，SLY-C微電腦自動數(shù)粒儀(杭州綠博儀器有限公司)。

2 方 法

試驗參照《農作物種子檢驗規(guī)程》(GB/T 3543-1995)[4]標準執(zhí)行。

2.1 扦 樣

種子批的最大重量為10 000 kg，送檢樣品最少為50 g，凈度分析試樣最少為5 g(不少于2 500粒)。

表1 種子來源信息

2.2 真實性鑒定

采用種子外觀形態(tài)法，隨機選取100粒種子，4組重復，利用顯微鏡、游標卡尺等儀器進行外觀形態(tài)觀察，并記錄觀察結果。

2.3 凈度測定

每一批次種子分別選取50 g，重復3次，供試種子去掉雜質和廢種子后，剩余潔凈種子的重量占樣品總重量的百分率即為種子凈度。

2.4 百粒重測定

利用自動數(shù)粒儀從“2.3”項下的凈種子中隨機數(shù)取100粒，8個重復，分別稱重，計算8個重復的平均質量、標準差及變異系數(shù)。變異系數(shù)不超過4.0%視為測定值有效。

2.5 含水量測定

采用高恒溫烘干法[5]，稱取各產地穿龍薯蕷種子樣品5 g于烘為恒重的稱量瓶中，130 ℃恒溫烘干3 h，計算種子含水量。

2.6 發(fā)芽率測定

將各產地穿龍薯蕷凈種子用清水沖洗掉泥沙，浸泡于75%乙醇中消毒40 min，后用大量清水沖凈乙醇，再用純凈水潤洗3遍備用。將各產地種子置于直徑150 mm，鋪有1層紗布1層濾紙的培養(yǎng)皿中 ，于20 ℃人工氣候培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天統(tǒng)計發(fā)芽率，每產地設置3次重復，每重復100粒種子。

2.7 生活力測定

采用四唑染色法進行。取各產地100粒新鮮種子，沿種脊將種子切成兩半，露出胚乳。滴入濃度為0.6%的TTC溶液浸沒種子，置于45 ℃恒溫培養(yǎng)箱中避光染色4 h[5]，3個重復。

3 實驗結果

3.1 外觀形態(tài)結果

穿龍薯蕷種子呈橢圓形，長比寬約大2倍，四周有不等的薄膜狀翅。種仁橢圓形，呈深棕色，腹側凹入處下緣具有點狀臍，由種臍向一側面伸出一線狀種脊。胚白色，胚芽明顯，具子葉一枚。

3.2 各項指標測定結果

對收集的27個產地的穿龍薯蕷種子樣品進行凈度、含水量、百粒重、發(fā)芽率、生活力等指標的測定，結果見表2。

結果顯示，山東、安徽、廣西、四川等4個地區(qū)的種子凈度較低(在85%以下)，其中廣西種子凈度明顯低于其他產區(qū)(低于65%)；吉林省柳河縣三源浦鎮(zhèn)、梅河縣山城鎮(zhèn)、遼寧省清原縣、英額門鎮(zhèn)丁家街村、內蒙古、陜西、山西的種子凈度較高，均達到95%以上；遼寧省與吉林省的種子為一年生，其百粒重在0.89～1.40 g之間，其他省份為二年生種子，其百粒重在160.28～210.08 g之間；含水量在7.34%～11.63%之間，其中遼寧省阜新市、本溪市、鞍山市種子含水量較低，均在8.00%以下，遼寧省清原縣大孤家鎮(zhèn)、新賓縣大四平鄉(xiāng)、內蒙古、甘肅、青海南部、寧夏、山西、山東、河北、河南、浙江北部、江西(廬山)、四川、廣西的種子含水量較高，均在10%以上。不同產地的穿龍薯蕷種子發(fā)芽率、生活力差異較大，發(fā)芽率在14%～88%之間，生活力在15%～94%之間。

4 數(shù)據(jù)分析處理

4.1 聚類分析

應用SPSS 20.0軟件對表2中測定的5項指標進行系統(tǒng)聚類分析，聚類方法采用最遠距離法，區(qū)間選擇平方歐氏距離，將27個產地的穿龍薯蕷種子在閾值10處分為兩級，結果如圖1。由圖1可知，遼寧不同產地的8批種子與吉林不同產區(qū)的3批種子為一類，其余各省及自治區(qū)為一類。

表2 不同產地穿龍薯蕷種子各指標測定結果

結合系統(tǒng)聚類分析的結果，初步將27個穿龍薯蕷種子進行了質量等級劃分，并將各等級不同指標的置信區(qū)間進行統(tǒng)計，見表3。

表3 穿龍薯蕷種子測定指標等級劃分區(qū)間

4.1.1 含水量等級劃分區(qū)間的確定

從聚類分析結果可以看出，一級種子和二級種子含水量的取值范圍存在重疊，一級種子含水量為7.34%～10.42%，二級種子含水量為9.31%～11.63%，不能通過含水量將一級種子和二級種子區(qū)分開來。為獲得更為準確的含水量等級劃分標準必須進行進一步數(shù)學處理，參照黃河[6]等的處理方法，具體如下：

1) 含水量等級界限的確定：按下列公式計算含水量界限。

M=(T1M小+T2M大)/2=(9.31+10.42)/2=9.865(%)，T1M小為一級種子含水量界限下限，T2M大為二級種子含水量界限上限。

因此，從含水量考慮，穿龍薯蕷種子一級和二級劃分界限為9.865%。

2) 含水量劃分等級的可行性分析：以含水量9.865%為等級劃分界限，將27個產地穿龍薯蕷種子樣品劃分為一級和二級，獲得一級種子15個，二級種子12個。對27個產地種子含水量數(shù)據(jù)進行正態(tài)性檢驗，符合正態(tài)分布，因此采用獨立樣本t檢驗法對一級種子和二級種子含水量進行統(tǒng)計分析，結果可知p=0.00<0.01，即以含水量9.865%為等級劃分界限時，兩級種子間存在極顯著性差異，故此劃分依據(jù)合理。

4.1.2 凈度等級劃分區(qū)間的確定

采用含水量等級區(qū)間劃分的相同方法，計算確定穿龍薯蕷種子一級品和二級品凈度的劃分界限為92.59%。以凈度92.59%為等級劃分界限，將27個產地種子樣品劃分為一級品和二級品，獲得一級品13個，二級品14個。對凈度數(shù)據(jù)進行正態(tài)性檢驗，不符合正態(tài)分布，因此采用秩和檢驗法對一級種子和二級種子含水量進行統(tǒng)計分析，結果可知p=0.00<0.01，即以凈度92.59%為等級劃分界限時，兩級種子間存在極顯著差異，故此劃分依據(jù)合理。

4.1.3 百粒重等級劃分區(qū)間的確定

根據(jù)聚類分析結果，一級品與二級品種子的百粒重分級區(qū)間為：一級品0.89～1.40 g，二級品160.28～210.08 g。對百粒重數(shù)據(jù)進行正態(tài)性檢驗，不符合正態(tài)分布，因此采用秩和檢驗法對一級種子和二級種子百粒重進行統(tǒng)計分析，結果可知p=0.00<0.01，即以一級品百粒重0.89～1.40 g，二級品百粒重160.28～210.08 g為等級劃分界限時，兩級種子間存在極顯著差異，故此劃分依據(jù)合理。

4.1.4 發(fā)芽率等級劃分區(qū)間的確定

采用含水量等級區(qū)間劃分的相同方法，計算確定穿龍薯蕷種子一級品和二級品發(fā)芽率的劃分界限為63%。將27個產地種子樣品劃分為一級品和二級品，獲得一級品10個，二級品17個。對發(fā)芽率數(shù)據(jù)進行正態(tài)性檢驗，符合正態(tài)分布，因此采用獨立樣本t檢驗法對一級種子和二級種子發(fā)芽率進行統(tǒng)計分析，結果可知p=0.00<0.01，即以發(fā)芽率63%為等級劃分界限時，兩級種子間存在極顯著差異，故此劃分依據(jù)合理。

圖1 穿龍薯蕷種子系統(tǒng)聚類分析樹狀圖

表4 穿龍薯蕷種子連續(xù)性變量測定指標等級劃分取值范圍

4.1.5 生活力等級劃分區(qū)間的確定

采用含水量等級區(qū)間劃分的相同方法，計算確定穿龍薯蕷種子一級品和二級品生活力的劃分界限為82%。將27個產地種子樣品劃分為一級品和二級品，獲得一級品10個，二級品17個。對生活力數(shù)據(jù)進行正態(tài)性檢驗，符合正態(tài)分布，因此采用獨立樣本t檢驗法對一級種子和二級種子生活力進行統(tǒng)計分析，結果可知p=0.00<0.05，即以生活力82%為等級劃分界限時，兩級種子間存在顯著差異，故此劃分依據(jù)合理。

4.2 穿龍薯蕷種子連續(xù)性變量測定結果等級劃分范圍的確定

根據(jù)上述分析結果，為提高標準的可執(zhí)行性，對各測定指標數(shù)據(jù)取值范圍進行調整和修正，結果見表4。

按表4中各測定指標修正后的取值范圍，同4.1項下分析方法進行獨立樣本t檢驗和秩和檢驗(服從正態(tài)分布的資料采用獨立樣本t檢驗，不服從正態(tài)分布的資料采用秩和檢驗)，所得穿龍薯蕷種子一級品和二級品之間均有顯著差異，p值均小于0.05，即劃分依據(jù)合理。故而根據(jù)上述數(shù)據(jù)處理結果，初步制定了穿龍薯蕷種子質量分級標準，見表5。將27個不同產地的穿龍薯蕷種子分為2個等級，分級方法采用最低定級原則，即任何一項指標不符合定級標準均不能作為相應等級的合格種子。分級結果為一級種子有6個，二級種子有21個。

表5 穿龍薯蕷種子質量分級標準結果

5 討 論

5.1在計算每一級種子置信區(qū)間范圍時，部分指標的置信區(qū)間發(fā)生了重疊。以含水量為例，為解決置信區(qū)間重疊的問題，參照黃河[6]的方法，以均數(shù)加減一個標準差確定一級種子和二級種子的正態(tài)分布范圍，結果如下：

一級種子和二級種子正態(tài)分布仍存在重疊，所以需要對數(shù)據(jù)進行進一步處理。取一級品指標的界限下限與二級品指標的界限上限中點為新的界限值，對其進行可行性分析，進而得出新的界限值具有可行性。得出各指標等級劃分取值范圍后，根據(jù)可執(zhí)行性與實際應用價值對取值范圍進行調整和修正，修正后的結果即為穿龍薯蕷種子質量分級標準結果。

5.2經過進一步數(shù)學處理后的結果與原聚類分析的結果有所不同，聚類分析結果中一級種子有11個，二級種子16個，而經過進一步界限值確定后結果為一級種子6個，二級種子21個。這是由于此分類方法很苛刻，提高了分類的要求。

5.3種子是個體植株的雛形，藥材質量的優(yōu)劣、產量的高低與中藥材種子的質量息息相關。種子商品處于整個中醫(yī)藥現(xiàn)代化產業(yè)鏈的上游，其質量優(yōu)劣的客觀評價直接影響后續(xù)產業(yè)鏈的進行[7-10]。目前關于穿龍薯蕷種子的質量等級劃分非常不清晰，很難對市售種子的質量進行有效的控制和評價，造成種子質量良莠不齊，嚴重影響規(guī)范化生產成效[11-13]。因此，本研究在對不同產地穿龍薯蕷種子全面收集的基礎上對其質量指標系統(tǒng)測定和質量分級標準進行了研究，初步制定了穿龍薯蕷種子質量分級方法，為規(guī)范和制定穿龍薯蕷種子質量標準提供依據(jù)，以期實現(xiàn)市售種子的規(guī)范化，從源頭控制穿龍薯蕷藥材的質量。

各類文獻規(guī)范數(shù)據(jù)選項表

注：“√”為必備項，“0”為任選項，“*”為有則加項，“-”為不要求項。