田景，金華，申國(guó)安*，郭寶林*，姜志海，李礫，楊相波

1.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 藥用植物研究所，北京 100193； 2.國(guó)藥集團(tuán)同濟(jì)堂(貴州)制藥有限公司，貴州 貴陽 550009

擬巫山淫羊藿EpimediumpseudowushanenseB.L.Guo為小檗科淫羊藿屬多年生草本植物，是國(guó)內(nèi)首個(gè)實(shí)現(xiàn)栽培化的淫羊藿屬藥用植物品種，其化學(xué)成分構(gòu)成以朝藿定C含量高為特點(diǎn)(1.5%以上)，優(yōu)于巫山淫羊藿，本課題組一直致力于開展淫羊藿的種植技術(shù)研究和規(guī)范化栽培，制定了擬巫山淫羊藿的種子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[1]，并調(diào)查了其生長(zhǎng)的土壤條件[2]。植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑在藥用植物栽培生產(chǎn)中用于促進(jìn)生根，提高成活率等已有較多研究[3-6]，本文則進(jìn)行了植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑促進(jìn)擬巫山淫羊藿芽數(shù)目進(jìn)而改善其栽培狀況的研究。

擬巫山淫羊藿和大多數(shù)淫羊藿屬植物一樣，是地面芽植物，地上部分的花莖和基生葉從根芽萌發(fā)生長(zhǎng)，而根芽是在上一年度秋冬季形成。淫羊藿的藥用部位是葉片，因此通過促進(jìn)冬季根芽形成可以提高第二年產(chǎn)量。

本課題組此前的研究發(fā)現(xiàn)6-BA及6-BA與尿素的綜合處理具有顯著的促進(jìn)擬巫山淫羊藿采收后再萌發(fā)的作用[7]，考慮到促進(jìn)冬芽形成和促進(jìn)采收后再萌發(fā)的作用對(duì)象都是腋芽，作用原理都是主要通過打破頂端優(yōu)勢(shì)以促進(jìn)腋芽膨大生長(zhǎng)或萌發(fā)成枝，具有一致性。因此本論文繼續(xù)研究了6-BA及尿素對(duì)秋冬根芽形成的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)材料選用二年生擬巫山淫羊藿EpimediumpseudowushanenseB.L.Guo實(shí)生苗，由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所郭寶林研究員鑒定。

1.2 儀器與試劑

儀器：珀金埃爾默HPLC儀器(Flexar PDA LC Detector，Totalchrom色譜工作站)，KQ-500DE 數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)，GZX-9070 MBE數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱(上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)，十萬分之一電子天平(瑞士MettlerToledo公司)，萬分之一天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司)，0.22 μm微孔濾膜(上海新亞凈化器件廠)。

試劑：無水乙醇(AR，北京化工廠)，乙腈(HPLC，F(xiàn)isher)，娃哈哈純凈水，鹽酸(AR，北京化工廠)。尿素(AR，99%)，6-BA(AR，99%)，均購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司。對(duì)照品朝藿定A，朝藿定B，朝藿定C及淫羊藿苷均為實(shí)驗(yàn)室自制，純度大于99%。

1.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

噴葉處理方式及灌根處理方式各一次實(shí)驗(yàn)，均采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)。

噴葉處理實(shí)驗(yàn)：于2016—2017年在貴州省雷山縣擬巫山淫羊藿栽培實(shí)驗(yàn)地(N 26°21′，E 108°1′，海拔1300 m)進(jìn)行。土壤全氮3.48 g·kg-1，有機(jī)質(zhì)48.7 g·kg-1，堿解氮222 mg·kg-1，有效磷63.1 mg·kg-1，速效鉀84.2 mg·kg-1，pH 4.40。設(shè)三個(gè)區(qū)組，6個(gè)處理，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)(詳見表1)，每處理面積3×1.2 m，約60株。于2016年11月25日下午及12月1日下午共施藥兩次，每次每個(gè)處理葉面噴施1 L。實(shí)驗(yàn)期間定期除草并預(yù)防和控制病蟲害。

灌根處理實(shí)驗(yàn)：于2017—2018年在貴州省雷山縣擬巫山淫羊藿栽培試驗(yàn)地(N 26°21′，E 108°5′，海拔1250 m)進(jìn)行，試驗(yàn)地土壤全氮2.51 g·kg-1，有機(jī)質(zhì)66.1 g·kg-1，堿解氮313 mg·kg-1，有效磷68.7 mg·kg-1，速效鉀130 mg·kg-1，pH 4.72。設(shè)3個(gè)區(qū)組，8個(gè)處理，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)(詳見表1)，每處理每區(qū)20株。2017年11月14、15日連續(xù)兩天施藥，每次每株灌根50 mL，將液體裝入自封袋，剪小口直接施到植株根部及附近的土壤上。實(shí)驗(yàn)期間定期除草并預(yù)防和控制病蟲害。

表1 促進(jìn)擬巫山淫羊藿根芽形成實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.4 秋冬芽和萌發(fā)生長(zhǎng)量統(tǒng)計(jì)

噴葉處理實(shí)驗(yàn)：在2016年11月24日，每處理標(biāo)記其中長(zhǎng)勢(shì)中等和均勻的13株。2017年，在上一年度首批根芽萌發(fā)且葉片成熟后的6月13日和14日，按株采收標(biāo)記植物的全部地上部分，帶回，晾干，然后統(tǒng)計(jì)每株的新地上部分重量(2017年新萌發(fā)部分)，老地上部分重量(2016年生長(zhǎng)的地上部分，一般老葉留存到在2017年6月下旬才開始逐步死亡)。

灌根處理實(shí)驗(yàn)：2018年，在當(dāng)年秋冬季根芽形成結(jié)束并即將開始萌發(fā)的2月6日和8日，每個(gè)處理取10株，將整株挖取，洗去泥土，記錄每株芽的數(shù)目(包括一級(jí)芽、二級(jí)芽)，記算總芽數(shù)(總芽數(shù)=二級(jí)芽+一級(jí)芽)(芽長(zhǎng)>6 mm)。因2018年早春倒春寒，多數(shù)最早萌發(fā)的幼嫩地上部分被凍死，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的剩余10株的萌發(fā)生長(zhǎng)量無法準(zhǔn)確統(tǒng)計(jì)。

1.5 淫羊藿苷類成分含量測(cè)定

噴葉處理實(shí)驗(yàn)：2016年12月22日每處理每株1片，取20株，及2017年6月13日取當(dāng)年萌發(fā)的成熟葉片20片，混合用于淫羊藿苷類成分含量測(cè)定。

灌根處理實(shí)驗(yàn)：于2018年4月30日每處理取當(dāng)年萌發(fā)的成熟葉片，每株2片，混合用于淫羊藿苷類成分含量測(cè)定。

淫羊藿苷類成分含量測(cè)定：葉片陰干，干燥葉片中朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C及淫羊藿苷含量的測(cè)定方法參考文獻(xiàn)[8]。

1.6 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 22.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析，Excel 2010作表及作圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 灌根處理對(duì)芽數(shù)目的影響

擬巫山淫羊藿形成于根狀莖節(jié)上的芽為腋芽，外面鱗片包被。根據(jù)芽的著生位置不同，將直接從老根狀莖(一般是上一年度形成)上產(chǎn)生的芽定義為一級(jí)芽，一級(jí)芽隨后不斷生長(zhǎng)，隨后此芽飽滿，生長(zhǎng)、伸長(zhǎng)變粗為新的根狀莖，根狀莖節(jié)上又有腋芽形成和膨大生長(zhǎng)，形成的新芽稱之為二級(jí)芽。一級(jí)芽和二級(jí)芽中長(zhǎng)度大于6 mm的芽一般會(huì)在第二年早春萌發(fā)，形成當(dāng)年的地上部分，4月末到6月初成熟，藥材產(chǎn)量也主要據(jù)此而計(jì)算，而小于6 mm的芽則多數(shù)不在早春萌發(fā)，因此本文僅計(jì)數(shù)大于6 mm的一級(jí)芽和二級(jí)芽。

由表2可以看出僅300 mg·L-1尿素和60 mg·L-16-BA的綜合處理顯著增加了總芽數(shù)目，較對(duì)照組增加44.08%(P<0.05)，表現(xiàn)為二級(jí)芽數(shù)目顯著較高，較對(duì)照組增加60.97%(P<0.05)。

30 mg·L-1的6-BA處理顯著降低了二級(jí)芽數(shù)目，但一級(jí)芽的數(shù)目較對(duì)照組顯著增加，較對(duì)組提高59.70%(P<0.05)，總芽數(shù)與對(duì)照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

不同濃度的尿素處理(Urea 300 mg·L-1、Urea 500 mg·L-1、1000 mg·L-1)對(duì)芽形成無顯著影響。

2.2 葉面噴施處理對(duì)產(chǎn)量的影響

2.2.1對(duì)處理后第二年薪萌發(fā)地上部分重量的影響 本次試驗(yàn)因故未能統(tǒng)計(jì)秋冬季的芽形成數(shù)目，但擬巫山淫羊藿在秋冬季形成的芽的數(shù)目越多，第二年新形成的植株地上部分產(chǎn)量就越多，因此也可以通過評(píng)價(jià)第二年新萌發(fā)地上部分重量來評(píng)價(jià)不同處理對(duì)冬芽形成的影響。

表2 不同處理對(duì)擬巫山淫羊藿中平均每株芽數(shù)目的影響

注：同列標(biāo)相同字母表示處理之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，標(biāo)不同字母表示處理之間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.05。

從圖1可以看出6-BA 60 mg·L-1的處理組新萌發(fā)地上部分重量顯著高于其他組，與清水對(duì)照組相比，重量增加22.76%(P<0.05)；60 mg·L-1的6-BA與300 m·L-1的尿素綜合處理組與對(duì)照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但比60 mg·L-1的6-BA處理組的重量少21.82%(P<0.05)。

注：不同字母表示兩處理之間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，相同字母表示兩處理之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。圖1 不同處理對(duì)擬巫山淫羊藿產(chǎn)量的影響

2.2.2 對(duì)老地上部分重量的影響 老地上部分為第二年6月初采收的植株中的上一年形成的部分。

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)6-BA 60 mg·L-1的老地上部分重量最高，較清水對(duì)照組增加38.49%。增加尿素的綜合處理(U 300 mg·L-1+6-BA 60 mg·L-1)與對(duì)照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但是比6-BA 60 mg·L-1處理組重量顯著降低18.1%(P<0.05)。

2.3 不同處理對(duì)淫羊藿苷類成分含量的影響

擬巫山淫羊藿中朝藿定C的含量占總淫羊藿苷類含量(四種淫羊藿苷類成分含量之和)的85%以上，因此本文總的淫羊藿苷類含量與朝藿定C含量變化一致。

從表3可以看出，在灌根處理實(shí)驗(yàn)中，各處理因素對(duì)新萌發(fā)的成熟葉片中朝藿定C和總的淫羊藿苷類黃酮成分的量無顯著影響。噴葉處理促進(jìn)根芽形成實(shí)驗(yàn)中，各處理組對(duì)老葉成熟葉片中朝藿定C的含量與對(duì)照組相比均差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，僅6-BA 90 mg·L-1處理組總淫羊藿苷類黃酮成分含量低于對(duì)照組，較對(duì)照組低6.8%(P<0.05)；各處理組對(duì)第二年新生成熟葉片中朝藿定C及總淫羊藿苷的含量與對(duì)照組相比均差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，僅6-BA 60 mg·L-1處理組朝藿定A、朝藿定B及淫羊藿苷的含量相對(duì)較低。

表3 不同處理對(duì)擬巫山淫羊藿中淫羊藿苷類黃酮成分含量的影響

注：同列標(biāo)相同字母表示處理之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，標(biāo)不同字母表示處理之間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.05。

3 擬巫山淫羊藿根芽發(fā)育及影響因素

在根芽形成初期(從8月開始)，主要形成較多的一級(jí)芽，在芽形成中后期，在一級(jí)芽的基礎(chǔ)上，才形成較多的二級(jí)芽，也繼續(xù)有一級(jí)芽形成。11月中旬為芽形成的中后期。灌根促進(jìn)根芽形成實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)300 mg·L-1的尿素和60 mg·L-1的6-BA的綜合處理顯著促進(jìn)二級(jí)芽數(shù)目進(jìn)而提高總芽數(shù)目，前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)該綜合處理同樣也是噴根處理促進(jìn)采收后再萌發(fā)的最適合處理[7]，進(jìn)一步驗(yàn)證了兩者作用的一致性，可能都是主要通過打破頂端優(yōu)勢(shì)促進(jìn)腋芽膨大或萌發(fā)，但是具體機(jī)制有待進(jìn)一步深入實(shí)驗(yàn)探討。單獨(dú)的6-BA或尿素處理均沒有表現(xiàn)出顯著促進(jìn)根芽數(shù)目的效果。其他研究也發(fā)現(xiàn)氮素和6-BA配合使用顯著提高了小麥分蘗節(jié)ZT含量，降低了內(nèi)源ABA、GA3含量，進(jìn)而顯著增加小麥分蘗發(fā)生率，顯著提高了分蘗芽長(zhǎng)度、鮮重[9]。

6-BA 60 mg·L-1的噴葉處理組淫羊藿的次年新萌發(fā)地上部分重量顯著高于其他組，該處理組老地上部分重量也顯著較對(duì)照組高，說明通過葉面噴施6-BA提高產(chǎn)量可能是6-BA處理增加光合速率，延緩衰老，使當(dāng)年積累營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)較多，進(jìn)而增加冬芽數(shù)目提高第二年產(chǎn)量。研究發(fā)現(xiàn)6-BA可能通過增加光合速率、抑制葉綠素降解，抑制氧自由基對(duì)植物的侵害及膜脂過氧化程度的加深，使葉片保持較高的抗氧化酶活性，從而延緩葉片衰老，例如300 mg·L-1的6-BA處理延緩牡丹葉片衰老[10]；12 g·L-1硝酸鉀和10 mg·g-16-BA 綜合處理可明顯改善假儉草Eremochloaophiuroides(Munro)Hack.的生長(zhǎng)，抑制其葉綠素的分解[11]；氨基酸硒和6-BA處理可有效延緩葡萄葉片衰老[12]；5 mg·L-16-BA的保鮮劑能有效延長(zhǎng)月季切花的瓶插壽命[13]；適宜濃度的6-BA處理能夠提高厚皮甜瓜坐果節(jié)位葉片光能利用效率[14]。 此外6-BA處理可顯著降低采后西蘭花的總呼吸強(qiáng)度，延緩西蘭花褪綠黃化[15]，延緩玉米根系的衰老及延緩葉片衰老，使成熟期綠葉面積增加，顯著增加吐絲期-成熟期植株吸氮量和植株干物質(zhì)積累量，顯著提高單株子粒產(chǎn)量[16]。同樣濃度的6-BA濃度和300 mg·L-1尿素綜合處理時(shí)，產(chǎn)量的提高并不顯著，說明通過葉面噴施處理時(shí)，尿素的存在反而削弱了6-BA的促進(jìn)作用。

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)通過噴葉處理單獨(dú)的6-BA 60 mg·L-1處理即可以增加老葉重量，進(jìn)而促進(jìn)新芽形成和萌發(fā)增加產(chǎn)量，而通過灌根處理時(shí)，6-BA 60 mg·L-1和尿素300 mg·L-1綜合處理更有利于芽數(shù)目的增多，說明葉片與根系對(duì)6-BA和尿素的吸收利用存在一定差異，尿素是有機(jī)態(tài)氮肥，經(jīng)過土壤中的脲酶作用，水解成碳酸銨或碳酸氫銨后，才能被作物吸收利用，葉片對(duì)尿素的吸收利用低于根系，氮素和6-BA只有在根系施用時(shí)才會(huì)發(fā)揮互作效應(yīng)。但是噴葉和灌根促進(jìn)芽形成進(jìn)而提高產(chǎn)量的機(jī)理和效果有何不同及是否可以同時(shí)進(jìn)行灌根和噴葉處理還有待進(jìn)一步研究。

此外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)葉面噴灑30 mg·L-16-BA或與300 mg·L-1尿素混合噴施，或90 mg·L-16-BA葉面噴施均能顯著提高植株的花枝數(shù)比例，這在采種田上可用來促進(jìn)開花結(jié)果。其他研究發(fā)現(xiàn)1 500 mg·L-1的6-BA可以顯著促進(jìn)花芽的分化，而濃度為500 mg·L-1時(shí)有抑制花芽分化的作用[17]，一定濃度6-BA 處理可以顯著提高富士蘋果幼樹短枝頂芽成花率[18]。

4 結(jié)論

300 mg·L-1的尿素和60 mg·L-1的6-BA的綜合處理灌根或6-BA 60 mg·L-1噴葉處理可顯著促進(jìn)擬巫山淫羊藿根芽形成，且對(duì)成熟葉片中的朝藿定C和總淫羊藿苷類成分不產(chǎn)生顯著影響。