張永春，王志強(qiáng)，孫晶晶，宋榮學(xué)，王冶

口腔癌是世界范圍內(nèi)普遍存在的惡性腫瘤，流行病學(xué)統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，世界各地的年發(fā)病例數(shù)約為263 000例，死亡例數(shù)約為128 000例[1-3]。鱗狀細(xì)胞癌(OSCC)是口腔癌最常見的病理類型之一，在中國尤為常見。近年來，腫瘤機(jī)制的研究深入，但有效的預(yù)防和早期診斷OSCC的措施很少見。由于OSCC復(fù)發(fā)率高，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移多見，5年生存率低于50%[4]。PI3K催化亞基(PIK3CA)位于3q26.3，編碼1 068個(gè)氨基酸，產(chǎn)生124 kD的蛋白質(zhì)，即PI3K p110催化亞單位α(PI3K p110α)[5-6]。有研究表明，PIK3CA能夠參與腫瘤發(fā)生發(fā)展的過程，且作為致癌基因[7]。PIK3CA基因突變能夠?qū)е翽I3K p110α的功能增強(qiáng)。通過PI3K p110α的催化功能，PIP3增加，這是激活PI3K/蛋白激酶B( PI3K/AKT)信號(hào)通路的重要媒介。為了探討PIK3CA基因多態(tài)性與口腔癌發(fā)生的關(guān)系，現(xiàn)對(duì)50例口腔癌病人以及50例健康人群的外周血標(biāo)本進(jìn)行分析，以期為臨床口腔癌的治療以及預(yù)后提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料赤峰學(xué)院附屬醫(yī)院于2015年1月至2016年11月期間收治了50例口腔鱗狀細(xì)胞癌病人(口腔癌組)以及50例健康人群(對(duì)照組)的外周血樣本，其中口腔癌組中男性30例，女性20例，年齡(51.5±5.3)歲，年齡范圍為41～77歲；對(duì)照組中男性32例，女性18例，年齡(52.6±6.1)歲，年齡范圍為43～74歲。口腔癌組與對(duì)照組在年齡和性別方面差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.323，P=0.754；χ2=0.05，P=0.820)，具有可比性。納入標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)病理活檢確診者。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)有其他癌癥病史；(2)精神異常者。本研究通過赤峰學(xué)院附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，病人或近親屬和健康志愿者均簽署知情同意書。

1.2研究方法

1.2.1 DNA提取 在所有樣本中用酚/氯仿抽提核酸的方法提取外周血的DNA。

1.2.2 引物合成 PIK3CA基因正向和反向的引物合成序列見表1，引物由上海烈冰生物技術(shù)有限公司合成。

表1 PIK3CA基因多態(tài)性檢測(cè)的引物設(shè)計(jì)

1.2.3 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增 預(yù)變性95 ℃ 4 min、變性95 ℃30 s、退火56 ℃30 s，延伸72 ℃ 30 s，72 ℃末延伸5 min；共35個(gè)循環(huán)；酶切體系及條件：10X FastDigest Gren Bufer 2 μL，F(xiàn)astDigestenzyme 1 μL(rs11615使用Eam1105I，rs13181使用AleI)，ddH2O 17 μL，PCR產(chǎn)物10 μL；水浴37 ℃酶切10 min，然后取出立即置水浴65 ℃滅活5 min；使用2%瓊脂糖凝膠，電泳45 min，電壓設(shè)置為145 V。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法使用Padgragh 6.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。采用χ2檢驗(yàn)分析Hardy-Weinberg遺傳平衡定律和兩組間基因型和等位基因頻率分布的差異。檢驗(yàn)水準(zhǔn)取雙側(cè)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn)PIK3CA rs4975596的AA、AG、GG基因型在對(duì)照組的數(shù)目分別為34例、12例、4例，符合Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn)(χ2=0.121，P=0.94)。

2.2PIK3CArs4975596基因型和等位基因頻率的分布由表2結(jié)果可知，PIK3CA rs4975596基因多態(tài)性均存在三種基因型，對(duì)各基因的三種基因型分布經(jīng)χ2檢驗(yàn)分析發(fā)現(xiàn)口腔癌組PIK3CA rs4975596的基因型分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=7.073，P=0.029)，提示不符合遺傳平衡。而對(duì)照組χ2=3.125,P=0.210，提示符合遺傳平衡。

PIK3CA rs4975596的A、G等位基因在口腔癌組的分布頻率分別為65%、35%；在正常對(duì)照組的分布頻率分別為76%、24%；兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=5.360，P=0.024)。結(jié)果見表3。

表2 PIK3CA rs4975596基因型頻率分布/例(%)

表3 PIK3CA rs4975596等位基因頻率分布/例(%)

2.3PIK3CArs4975596多態(tài)性與口腔癌發(fā)生的關(guān)系分析PIK3CA rs4975596基因的基因型與口腔癌的關(guān)系時(shí)發(fā)現(xiàn)PIK3CA的G(突變型)等位基因與A(野生型)等位基因比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=6.349，P=0.005)，而KIK3CA的GG基因型與AA基因型比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=5.831，P=0.034)。結(jié)果見表4。

表4 PIK3CA rs4975596基因多態(tài)性與口腔癌的關(guān)系

2.4PCR擴(kuò)增對(duì)PIK3CA rs4975596位點(diǎn)的野生型、雜合突變型和純合突變型三種基因型和樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增，2%瓊脂變性凝膠電泳結(jié)果顯示，PCR擴(kuò)增的DNA產(chǎn)物片段大小與預(yù)期相同，在91 bp附近，每孔只有一條亮帶，條帶清晰無雜帶，PCR擴(kuò)增特異性好。見圖1。

圖1 PCR擴(kuò)增的電泳結(jié)果

3 討論

口腔鱗狀細(xì)胞的發(fā)生、發(fā)展是由多種因素參與，通過誘導(dǎo)基因突變、干擾細(xì)胞周期調(diào)控等機(jī)制作用于免疫系統(tǒng)，是協(xié)同作用的一個(gè)動(dòng)態(tài)過程[8]。這個(gè)過程可能涉及多種致癌基因和抑癌基因位點(diǎn)突變、缺失、甲基化和拷貝數(shù)的變化等，這些遺傳學(xué)改變的累積終將引發(fā)口腔鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生[9]。根據(jù)之前的研究報(bào)道顯示，PIK3CA參與了腫瘤的發(fā)展過程并可作為致癌基因[7]。突變使得基因重復(fù)過度活躍，導(dǎo)致PIK3CA出現(xiàn)擴(kuò)增和PI3Kp110α的增強(qiáng)功能。通過PI3K p110α的催化功能，PIP3增加，這是激活PI3K/AKT信號(hào)通路的重要媒介。PIP3與磷酸肌醇依賴蛋白激酶1(PDK1)的C末端同源性結(jié)構(gòu)域結(jié)合，激活PDK1?；罨腜DK1磷酸化AKT的第308蘇氨酸。在此基礎(chǔ)上，磷酸肌醇依賴性蛋白激酶2(PDK2)磷酸化AKT的第473位，因此，PI3K/AKT信號(hào)通路被激活[10-11]。以前的研究表明，PI3K/AKT信號(hào)通路被基因頻繁的突變激活以促進(jìn)腫瘤生長[12]。PIK3CA的遺傳多態(tài)性還與多種癌癥的發(fā)生有關(guān)，比如頭頸鱗狀細(xì)胞癌[7]，食管鱗狀細(xì)胞癌[13]，非小細(xì)胞肺癌[14]，乳腺癌[5，15]，子宮內(nèi)膜癌[16-17]，胃癌[18]和直腸癌[19-20]。

本次研究的結(jié)果顯示，PIK3CA rs4975596基因型與等位基因頻率分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，并且PIK3CA rs4975596 GG基因型和G等位基因與口腔癌顯著相關(guān)，說明了PIK3CA rs4975596基因多態(tài)性在口腔癌發(fā)生過程中是危險(xiǎn)因素。本研究中雖然分析了PIK3CA基因型、等位基因與口腔癌發(fā)展的關(guān)系，但由于樣本量局限，在后續(xù)研究中需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本數(shù)量。遺傳多態(tài)性在很多癌癥研究中被認(rèn)為發(fā)揮著重要作用。PIK3CA正在成為腫瘤細(xì)胞存活的關(guān)鍵因素。研究顯示，PIK3CA突變通常出現(xiàn)在腫瘤發(fā)生的晚期，就在入侵之前或與入侵一致[18]，說明PIK3CA可能與癌細(xì)胞的侵襲密切相關(guān)。此外，PIK3CA多態(tài)性導(dǎo)致腫瘤組織中PI3K信號(hào)通路的增強(qiáng)，也表明PIK3CA可能參與腫瘤形成[13]。因此，建立預(yù)測(cè)性生物標(biāo)志物用于早期評(píng)估口腔癌是非常有必要的，通過檢測(cè)基因多態(tài)性的預(yù)處理識(shí)別能夠指導(dǎo)臨床醫(yī)生開展合理地治療，對(duì)穩(wěn)定病人病情非常有幫助。我們的研究提出了PIK3CA基因多態(tài)性與口腔癌發(fā)生的關(guān)聯(lián)，并指出了PIK3CArs4975596 GG、等位基因G能夠作為口腔癌發(fā)生的危險(xiǎn)因素，可以作為早期預(yù)防口腔癌的臨床標(biāo)志物。

綜上所述，口腔癌病人腫瘤細(xì)胞中的PIK3CA多態(tài)性與口腔癌發(fā)生顯著相關(guān)，檢測(cè)其多態(tài)性對(duì)早期發(fā)現(xiàn)口腔癌有一定價(jià)值。