姚 霞，聶 立，蘭瑞容，彭章明，崔小亮

（1.宜賓市食品藥品檢驗檢測中心，四川 宜賓 644000；2.宜賓五糧液有機農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司，四川 宜賓 644000）

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（deoxynivalenol，DON），又稱嘔吐毒素，是最常見的一種污染糧食、飼料和食品的霉菌毒素之一[1]，屬于單端孢霉烯族化合物，主要由禾谷鐮刀菌（Fusarium graminearum）、黃色鐮刀菌（Fusarium culmorum）、雪腐鐮刀菌（Fusarium nivale）等真菌產(chǎn)生的次級有毒代謝物[2-34]。DON可以干擾核糖體肽基轉(zhuǎn)移酶的活性，阻礙體內(nèi)的核糖體正常循環(huán)，并且抑制蛋白質(zhì)的合成，大量攝入會引起急性中毒，主要表現(xiàn)有頭疼、頭暈及嘔吐，中樞神經(jīng)系統(tǒng)紊亂等[5-6]。DON穩(wěn)定性強，具有較強的耐熱性和耐酸性[7]，在中性或酸性環(huán)境中，100℃、2 h只能小部分被破壞，有研究表明，DON使家兔的心、肝、腎和脾的組織細(xì)胞出現(xiàn)腫脹、空泡變性、炎性細(xì)胞浸潤及細(xì)胞壞死的病理變化[8]，可促進免疫細(xì)胞凋亡并抑制免疫細(xì)胞增長，嚴(yán)重影響人和牲畜的健康。檢測被其污染糧食作物（小麥、大麥、玉米等）刻不容緩，以避免人蓄誤食，引起不必要的損害。

國標(biāo)GB 5009.111—2016《食品中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇及其乙?；苌锏臏y定》中規(guī)定了DON的四個檢測方法，分別是同位素稀釋液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（liquid chromatography-massspectrometry，LC-MS）、免疫親和層析凈化高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法、薄層色譜測定法、酶聯(lián)免疫吸附篩查法。前人做過很多工作，研究出很多DON的檢測方法，比較常見成熟檢測方法有高效液相色譜法[9-10]、氣相色譜法[11-12]、液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法[13-15]、膠體金試紙條法[16]、薄層色譜法和酶聯(lián)免疫吸附篩查法[17]等。膠體金試紙條法、薄層色譜和酶聯(lián)免疫法成本較低，對檢測人員要求不高，前處理方法較簡單，一般用于定性和半定量檢測。高效液相色譜法和液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法，前處理相較麻煩，靈敏度高，能夠準(zhǔn)確的定性和定量檢測。本研究分別比較免疫親和柱-高效液相色譜法、免疫親和柱-液質(zhì)聯(lián)用外標(biāo)法和免疫親和柱-液質(zhì)聯(lián)用內(nèi)標(biāo)法對脫氧雪腐鐮刀菌烯醇進行檢測分析，旨在選擇更準(zhǔn)確高效、經(jīng)濟適用、環(huán)保的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玉米：市售；乙腈、甲醇（均為色譜純）：美國Fisher Chemical公司；氨水、聚乙二醇（均為分析純）：成都科龍化工試劑公司；IAC-SEP免疫親和柱（1.2μg/2 mL）：北京中檢維康生物技術(shù)有限公司；13C15-脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（25μg/mL，1 mL/支）：美國SIGMA-ALDRICH公司；脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（1 mg/支）：新加坡PRIBOLAB公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SCIEX QTrap 4500液質(zhì)聯(lián)用儀：美國AB公司；e2695/2298液相色譜儀：美國Waters公司；ULUP-II-107超純水機：西安優(yōu)普儀器設(shè)備有限公司；HSC-24A氮吹儀：天津市恒奧科技發(fā)展有限公司；LD5-2A離心機：北京京立離心機有限公司；SB25-12超聲波儀：寧波新芝生物科技公司。

1.3 方法

1.3.1 高效液相色譜條件

Waters Symmetry C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5μm），進樣體積：20 μL，流速：1 mL/min，停止時間：15 min，流動相：水∶乙腈=90∶10（V/V），等度洗脫，柱溫35 ℃，紫外檢測波長218 nm。

1.3.2 液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜條件

Waters Symmetry C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5μm），進樣體積：5 μL，流速：0.8 mL/min，停止時間：10 min，流動相：0.01%氨水溶液+乙腈，梯度洗脫，洗脫程序為98%氨水溶液+2%乙腈，維持0.8 min，98%氨水溶液+2%乙腈，維持0.8 min，76%氨水溶液+24%乙腈，維持3.2 min，100%乙腈，維持1 min，98%氨水溶液+2%乙腈，維持5 min。

質(zhì)譜條件：多反應(yīng)監(jiān)測（multiple reaction monitoring，MRM），噴霧電壓4 500 V，離子源溫度600℃，噴霧器Gas 1∶60，輔助氣Gas 2∶70，碰撞氣：中氣壓模式medium，MRM參數(shù)見表1。

表1 脫氧雪腐鐮刀菌烯醇分析的MRM參數(shù)Table 1 MRM parameters of deoxynivalenol analysis

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液制備

加乙腈1 mL于脫氧雪腐鐮刀菌烯醇標(biāo)準(zhǔn)品裝樣瓶，振蕩，使溶解，轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中，多次用乙腈洗滌標(biāo)準(zhǔn)品裝樣瓶，洗滌液均轉(zhuǎn)移至容量瓶中，最后用乙腈定容至10 mL，搖勻，得到質(zhì)量濃度為100μg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲備液。取1 mL標(biāo)準(zhǔn)儲備液于10 mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度，搖勻，得到質(zhì)量濃度為10μg/mL標(biāo)準(zhǔn)工作液。

精密量取13C15-脫氧雪腐鐮刀菌烯醇內(nèi)標(biāo)1 mL于25 mL容量瓶中，用乙腈溶解并定容至25 mL搖勻，配成內(nèi)標(biāo)溶液，質(zhì)量濃度為1 000 ng/mL。

HPLC法標(biāo)準(zhǔn)曲線配制：準(zhǔn)確移取10μg/mL標(biāo)準(zhǔn)工作液10μL、20μL、50μL、100μL、200μL、500μL于進樣瓶中，用乙腈+水（10∶90，V/V）定容至1 mL，得到質(zhì)量濃度分別為100 ng/mL、200 ng/mL、500 ng/mL、1 000 ng/mL、2 000 ng/mL、5 000 ng/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。LC-MS法標(biāo)準(zhǔn)曲線配制：將10μg/mL標(biāo)準(zhǔn)工作液用乙腈稀釋10倍，得到質(zhì)量濃度為1 000 ng/mL標(biāo)準(zhǔn)工作液，準(zhǔn)確移取上述標(biāo)準(zhǔn)工作液10μL、20μL、50μL、100μL、200μL、500μL于進樣瓶中，再分別加入100μL內(nèi)標(biāo)溶液（外標(biāo)法不加入內(nèi)標(biāo)），用0.01%氨水+乙腈（98∶2，V/V）定容至1 mL，得到質(zhì)量濃度為10 ng/mL、20 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL、200 ng/mL、500 ng/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，內(nèi)標(biāo)質(zhì)量濃度為100 ng/mL。

1.3.4 樣品制備

HPLC法前處理：稱取打碎的谷物制品25 g（精確到0.1 g）于具塞三角瓶中，加入5 g聚乙二醇（分散劑），加入純水100 mL，振蕩混勻，置于超聲波儀中超聲30 min，4 000 r/min離心5 min，收集上清液待凈化；先將冷藏的免疫親和柱恢復(fù)至室溫，待免疫親和柱內(nèi)原有液體流盡后，準(zhǔn)確移取上清液2 mL至免疫親和柱中，控制流速1滴/秒，直至空氣進入免疫親和柱中，再分別用5 mL磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffered solution，PBS）和5 mL水先后淋洗免疫親和柱，控制流速每秒1～2滴，棄去全部流出液，抽干小柱。準(zhǔn)確加入2 mL甲醇洗脫免疫親和柱，控制流速每秒1滴，收集全部流出液，再于45℃水浴氮吹近干，準(zhǔn)確加入1 mL初始流動相，渦旋30 s溶解殘渣，過0.45μm濾膜，收集濾液于進樣瓶中供液相色譜測定。

LC-MS法前處理：稱取打碎的谷物制品約2 g（精確到0.01 g）于50mL離心管中，內(nèi)標(biāo)法加入400μL內(nèi)標(biāo)溶液，外標(biāo)法不加，振蕩混合后靜置30 min，加入20 mL乙腈-水（84∶16，V/V）溶液置于超聲波儀中超聲30 min，4 000 r/min離心5 min，收集上清液待凈化；準(zhǔn)確移取上清液5 mL于45℃水浴氮吹干，加入2 mL水充分溶解殘渣，事先將冷藏的免疫親和柱恢復(fù)至室溫，待免疫親和柱內(nèi)原有液體流盡后，將上述溶液轉(zhuǎn)移至免疫親和柱中，后續(xù)步驟同液相法的凈化過程，不同的是過0.22μm濾膜，收集濾液于進樣瓶中供液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜測定。

1.3.5 方法學(xué)驗證

精密度試驗：按照樣品測定方法，HPLC法吸取質(zhì)量濃度為1 000 ng/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液，LC-MS法吸取質(zhì)量濃度為100 ng/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別連續(xù)測定6次，比較測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD），考察兩種方法的精密度。

加標(biāo)回收試驗：取空白玉米樣品，分別做3個水平加標(biāo)回收試驗，每個水平做3個平行，分別根據(jù)上述前處理方法處理，色譜方法上機檢測，考察檢測方法的準(zhǔn)確度。

重復(fù)性試驗：分別取3個不同的玉米樣品，各做兩個平行試驗，前處理按照上述方法進行，免疫親和柱凈化，分別上高效液相色譜和液質(zhì)聯(lián)用儀分析，考察檢測方法的重復(fù)性。

2 結(jié)果與分析

2.1 線性關(guān)系對比

在HPLC條件下，取上述不同質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液供HPLC分析，以出峰時間定性，峰面積定量，標(biāo)準(zhǔn)曲線及液相色譜圖結(jié)果分別見圖1和圖2。由圖1可知，脫氧雪腐鐮刀菌烯醇標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=74 700x-1 770，相關(guān)系數(shù)R=0.999 9，表明二者線性關(guān)系良好。由圖2可知，脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的保留時間為8.279 min。

圖1 脫氧雪腐鐮刀菌烯醇液相色譜法標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of deoxynivalenol by HPLC

試驗過程中發(fā)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度5 000 ng/mL的點峰型趴，不尖銳，不對稱，當(dāng)把標(biāo)準(zhǔn)工作液的配制溶液由乙腈換成乙腈+水（10∶90，V/V）之后，再配制標(biāo)準(zhǔn)曲線的最大濃度點，峰型既對稱又尖銳，分析原因是受溶劑效應(yīng)影響，標(biāo)準(zhǔn)工作溶液是純乙腈配制，標(biāo)準(zhǔn)曲線是用流動相配的，而最大的濃度點添加了500μL的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，水的極性大于乙腈極性，導(dǎo)致最大濃度點的溶液極性強度小于流動相極性強度，峰型變趴，換了標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配制溶劑后，再配制標(biāo)準(zhǔn)曲線的點，峰型既對稱又尖銳。

圖2 脫氧雪腐鐮刀菌烯醇液相色譜圖Fig.2 Liquid chromatogram of deoxynivalenol

在LC-MS條件下，取上述不同質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液供LC-MS分析，標(biāo)準(zhǔn)曲線及離子色譜圖結(jié)果分別見圖3和圖4。內(nèi)標(biāo)法以出峰時間和定性離子與定量離子的離子比定性，內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)確定量；外標(biāo)法以出峰時間和定性離子定性，定量離子峰面積定量。由圖3可知，內(nèi)標(biāo)法標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=0.008 39x+0.011 06，外標(biāo)法標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=7 333.5x+3 752.4，相關(guān)系數(shù)R2均為0.999 9，表明二者線性關(guān)系良好。由圖4可知，LC-MS條件下，外標(biāo)法和內(nèi)標(biāo)法脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的保留時間均為5.34 min。試驗過程中沒有發(fā)現(xiàn)峰型趴而不尖銳，可能是因為液質(zhì)條件下進樣體積減小，受溶劑效應(yīng)影響小。

圖3 脫氧雪腐鐮刀菌烯醇液質(zhì)聯(lián)用內(nèi)標(biāo)法（A）及外標(biāo)法（B）分析標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 Standard curve of deoxynivalenol analysis by LC-MS with internal(A)and external(B)standard method

圖4 脫氧雪腐鐮刀菌烯醇液質(zhì)聯(lián)用分析離子色譜圖Fig.4 Ion chromatogram of deoxynivalenol analysis by LC-MS

結(jié)果表明，無論是高效液相色譜法還是液質(zhì)聯(lián)用法，線性關(guān)系都非常好，LC-MS出峰時間比HPLC法快。HPLC法受溶劑效應(yīng)影響大，避免溶劑效應(yīng)要用流動相配制標(biāo)準(zhǔn)品和樣品。

2.2 精密度試驗

表2 精密度試驗結(jié)果Table 2 Results of precision tests

按照樣品測定方法，HPLC法吸取質(zhì)量濃度為1000 ng/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液，LC-MS法吸取質(zhì)量濃度為100 ng/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別連續(xù)上機測定6次，得到兩種方法精密度試驗結(jié)果如表2所示。由表2可知，HPLC法相對標(biāo)準(zhǔn)偏差最大，為1.31%，LC-MS外標(biāo)法其次，為1.20%，LC-MS內(nèi)標(biāo)法最小，為0.37%，即LC-MS內(nèi)標(biāo)法精密度最高。但兩種方法精密度均能滿足試驗需求。

2.3 回收率試驗

取空白玉米樣品，分別做低、中、高3個水平加標(biāo)回收試驗，每個水平做3個平行。LC-MS內(nèi)標(biāo)法同時還加入內(nèi)標(biāo)，LC-MS法的加標(biāo)量分別是40μg/kg、200μg/kg、1 000μg/kg，HPLC法的加標(biāo)量分別是200μg/kg、1 000μg/kg、2 000μg/kg。按照上述試驗方法處理上機，得到加標(biāo)回收率試驗結(jié)果見表3。由表3可知，LC-MS內(nèi)標(biāo)法的回收率在113.48%～119.27%，LC-MS外標(biāo)法回收率在105.56%～108.71%，HPLC法的回收率在80.77%～91.92%，其結(jié)果相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）均＜5%。結(jié)果表明，3種方法均具有良好的準(zhǔn)確度，均能滿足檢測要求。

表3 加標(biāo)回收率試驗結(jié)果Table 3 Results of adding standard recovery rate tests

2.4 重復(fù)性試驗

按照樣品測定方法，分別測定樣品1、2、3中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇含量，考察方法的重復(fù)性，結(jié)果見表4。

表4 重復(fù)性試驗結(jié)果Table 4 Results of repeatability tests

由表4可知，樣品1沒有被脫氧雪腐鐮刀菌烯醇污染，樣品2和樣品3輕度污染，GB 2761—2017《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中真菌毒素限量》為1 000μg/kg，3個玉米樣品均符合國家標(biāo)準(zhǔn)要求。每個樣品兩次測定結(jié)果非常接近，重復(fù)性試驗結(jié)果RSD均＜5%，表明重復(fù)性良好。

2.5 方法定量限和檢出限

按照S/N=10和S/N=3分別計算兩種方法的定量限和檢出限，得到HPLC法的定量限和檢出限分別為76.82μg/kg、23.05 μg/kg，低于國標(biāo)[17]給定的定量限200 μg/kg、檢出限100μg/kg。LC-MS法的定量限和檢出限分別為1.67μg/kg、0.502 μg/kg，低于國標(biāo)[17]給定的定量限20 μg/kg、檢出限10μg/kg。結(jié)果表明，LC-MS法比HPLC法靈敏度高，兩種方法均能滿足國家標(biāo)準(zhǔn)要求。

2.6 樣品實際檢測

分別取3個不同的玉米樣品，各做兩個平行試驗，前處理按照上述方法進行，免疫親和柱凈化[18-21]，分別上高效液相色譜和液質(zhì)聯(lián)用儀分析，檢測結(jié)果見表5。由表5可知，HPLC法檢測發(fā)現(xiàn)只有1個陽性樣品，而LC-MS內(nèi)標(biāo)法和外標(biāo)法檢測發(fā)現(xiàn)3個樣品均為陽性樣品。對比兩個試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，樣品1和樣品2，用HPLC法檢測是陰性，而LC-MS法檢測是陽性，含量均＜100μg/kg。

表5 不同玉米樣品中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇含量的檢測結(jié)果Table 5 Determination results of deoxynivalenol content in different corn samples

為分析原因，做了空柱回收試驗，即按試驗流程，不加任何樣品，只用試劑，上機檢測發(fā)現(xiàn)高效液相色譜未檢測到任何峰圖，而液質(zhì)聯(lián)用儀檢測出脫氧雪腐鐮刀菌烯醇，質(zhì)量濃度為19.384 ng/mL，說明這批免疫親和柱有本底，而液質(zhì)聯(lián)用方法靈敏度比液相法高，檢出限更低，造成樣品1為假陽性，樣品2被脫氧雪腐鐮刀菌烯醇輕度污染，因為液相色譜靈敏度低，在其檢出限以下，未能檢測出來。樣品3兩種儀器均檢測出脫氧雪腐鐮刀菌烯醇，液相色譜檢測出來比液質(zhì)聯(lián)用法低一些，是由于液質(zhì)聯(lián)用儀靈敏度高，免疫親和柱有本底，液質(zhì)聯(lián)用外標(biāo)法檢測的結(jié)果中有本底，液質(zhì)聯(lián)用內(nèi)標(biāo)法經(jīng)內(nèi)標(biāo)校正后造成結(jié)果偏高。

3 結(jié)論

比較免疫親和柱-高效液相色譜（HPLC）法和免疫親和柱-液質(zhì)聯(lián)用（LC-MS）法檢測脫氧雪腐鐮刀菌烯醇。結(jié)果表明，兩種方法的線性關(guān)系均良好，R2=0.999 9；HPLC法、LC-MS外標(biāo)法及內(nèi)標(biāo)法精密度試驗結(jié)果相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）分別為1.31%、1.20%及0.37%，回收率分別在80.77%～91.92%、108.71%～105.56%及113.48%～119.27%，精密度，回收率及重復(fù)性試驗結(jié)果RSD均＜5%；HPLC法的定量限和檢出限分別為76.82 μg/kg、23.05 μg/kg，LC-MS法的定量限和檢出限分別為1.67μg/kg、0.502μg/kg，均低于國標(biāo)給定標(biāo)準(zhǔn)。

比較兩種儀器的檢測方法，LC-MS內(nèi)標(biāo)法，需要脫氧雪腐鐮刀菌烯醇內(nèi)標(biāo)，我國尚未研制脫氧雪腐鐮刀菌烯醇生物標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)[22]，這些標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)一般都是進口，價格昂貴，一支13C15-脫氧雪腐鐮刀菌烯醇內(nèi)標(biāo)幾千塊，只能做50批樣品左右，試驗成本大大提高。LC-MS法使用乙腈浸提，HPLC法使用水浸提，乙腈價格較高，有機物對實驗人員也有一定傷害。在食品檢測過程中，兩種方法均能滿足檢測要求，綜合考慮HPLC法更經(jīng)濟環(huán)保。在食品的脫氧鐮刀菌烯醇的檢測試驗中，HPLC法線性和加標(biāo)回收均能滿足檢測需要，實驗室大批量檢測時，HPLC法是較理想的選擇。