姚淑敏，郭 倩，王 萍，陳 珊，宋晴晴，徐凱峰

（曲阜師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山東 曲阜 273165）

利用耐受性酵母生產(chǎn)乙醇在成本和便利性方面具有一定的優(yōu)勢，如耐酸酵母在酸性條件下（pH＜4）發(fā)酵產(chǎn)乙醇可最大限度地減少細(xì)菌污染的風(fēng)險和降低消毒的成本[1-3]。另外，酵母對鹽的耐受性（如硫酸鈉）也是工業(yè)生產(chǎn)生物乙醇和釀酒業(yè)的重要研究內(nèi)容之一。產(chǎn)乙醇酵母菌包括釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和非釀酒酵母（non-Saccharomyces），國內(nèi)外對釀酒酵母的乙醇、酸、鹽、糖脅迫已有廣泛的研究[4-8]。大多數(shù)釀酒酵母能在pH 2.5～8.5生長，但它們屬于嗜酸性生物，在酸性條件下生長會更好，其生長的最適pH范圍為pH 4.0～6.0。在葡萄酒釀造期間，釀酒酵母常在發(fā)酵開始階段受到低pH脅迫。非釀酒酵母對環(huán)境脅迫的耐受性研究，主要集中在對一些畢赤酵母（Pichia pastoris）、假絲酵母（Candida）和漢森酵母（Hansenula polymorpha）的研究[9-10]。LIC等[11]研究畢赤酵母A16對金屬鋅的耐受性，結(jié)果表明，畢赤酵母A16可以在0.5 mmol/L鋅環(huán)境中去除96.09%的鋅；LIC等[12]研究畢赤克魯維酵母（Pichia kluyver）對多種鹽和高溫的耐受性，結(jié)果表明，畢赤克魯維酵母可以在44 ℃和0.1 mol/L KNO3、Na2SO4以及0.2 mol/L的NaCl、KCl、NaNO3、K2SO4、MgCl2條件下正常生長，生長量達(dá)到3.64 g/L。

研究發(fā)現(xiàn)有些種類的東方伊薩酵母比釀酒酵母具有高的耐受性，如耐高溫、耐酸堿等[13-16]，因此在工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)生物乙醇和丁二酸上有著極其重要的地位[17]。MIAO Y等[16]利用高通量轉(zhuǎn)錄組對東方伊薩酵母耐乙醇的能力進行研究，結(jié)果表明，東方伊薩酵母耐受10%vol乙醇。KOUTINASM等[15]研究發(fā)現(xiàn)，東方伊薩酵母菌MF-121在含高濃度硫酸鈉的酸性介質(zhì)（pH=2.0）中或在高溫（溫度為43℃）條件下能夠產(chǎn)生大量的乙醇，具有較好的耐受性。

前期實驗已對分離自甜酒釀的東方伊薩酵母FJ-J-3進行了耐乙醇、耐高溫的研究[18]，發(fā)現(xiàn)菌株FJ-J-3能夠耐受16%vol的初始乙醇含量，但是不能耐高溫。為了進一步了解菌株FJ-J-3對環(huán)境條件的耐受性，對該菌株進行了pH和硫酸鈉（Na2SO4）的耐受性研究，為菌株發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的進一步開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

東方伊薩酵母菌（Issatchenkia orientalis）FJ-J-3：本實驗室分離自甜酒曲。

1.1.2 培養(yǎng)基

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast peptone dextrose，YPD）培養(yǎng)基[19]：葡萄糖20 g，酵母浸粉10 g，蛋白胨20 g，瓊脂粉32 g，蒸餾水定容至1 L，115℃滅菌15 min。

液體YPD培養(yǎng)基：YPD培養(yǎng)基中不加瓊脂粉。

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖20 g，酵母浸粉10 g，蛋白胨20 g，蒸餾水定容至1 L，115℃滅菌20 min。

脅迫發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖50 g，酵母浸粉10 g，蛋白胨20 g，蒸餾水定容至1 L，115 ℃滅菌15 min后，用H2SO4和NaOH調(diào)培養(yǎng)基的pH值分別為2.0、4.0、6.0、8.0。在不同pH條件下分別配制Na2SO4含量分別為2%、4%、6%的培養(yǎng)基，以不加Na2SO4的培養(yǎng)基為對照。

1.1.3 試劑

酵母浸出粉（生化試劑）：英國OXOID公司；蛋白胨、葡萄糖（均為生化試劑）：北京鴻潤寶順科技有限公司；硫酸鈉（Na2SO4）（分析純）：上海影佳實業(yè)發(fā)展有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

GC-2010氣相色譜（gas chromatography，GC）儀（配帶氫火焰離子化檢測器（flame ionization detector，F(xiàn)ID）、微機工作站、RTX R-5色譜柱（30 m×0.32 mm×0.5μm））：日本島津公司。GN-9080隔水式恒溫培養(yǎng)箱：上海精宏實驗設(shè)備有限公司；HNY-2102c恒溫培養(yǎng)振蕩器：天津歐諾儀器股份有限公司；H.H.S-214B電熱恒溫水浴鍋：上海醫(yī)療器械股份有限公司；H2050R臺式高速冷凍離心機：湖南長沙湘儀離心機儀器有限公司；UV-5500可見光分光光度計：上海元析儀器有限公司；LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌鍋：上海申安醫(yī)療器械廠。

1.3 方法

1.3.1 菌種活化

將保藏的東方伊薩酵母菌（Issatchenkia orientalis）FJ-J-3解凍后，劃線于YPD固體培養(yǎng)基上，28℃條件下培養(yǎng)24 h后重復(fù)活化一次。在活化好菌種的培養(yǎng)基上挑取單菌落特征明顯的I.orientalis FJ-J-3接種于裝有25 mL YPD液體培養(yǎng)基的100 mL錐形瓶中，于28℃、170 r/min條件下培養(yǎng)至OD600nm值=0.4時，10 000 r/min、4 ℃條件下離心10 min，棄上清，用5 mL無菌水洗滌菌體兩次并制備OD600nm值=1.0的種子液。

1.3.2 pH及鹽脅迫對酵母菌生長的影響

取1 mL種子液分別接種于16種YPD脅迫發(fā)酵培養(yǎng)基中，裝液量為25 mL/100 mL，于28℃、170 r/min條件下培養(yǎng)，每隔12 h定時取樣測定I.orientalis FJ-J-3的OD600nm值和乙醇含量。

1.3.3 測定方法

菌體生物量：利用分光光度計法，在波長600 nm處測定其吸光度值。

乙醇含量：按照參考文獻(xiàn)[20]的方法進行測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 pH為2.0條件下不同鹽含量對菌株FJ-J-3的影響

當(dāng)培養(yǎng)基pH=2.0時，東方伊薩酵母FJ-J-3在不同的Na2SO4的含量培養(yǎng)基中的生長狀況及乙醇含量結(jié)果見圖1。

圖1 菌株FJ-J-3在p H為2.0的不同Na2SO4含量培養(yǎng)基中的生長曲線（A）及乙醇含量（B）Fig.1 Growth curve(A)and ethanol content(B)of strain FJ-J-3 in medium with pH 2.0 and different Na2SO4 contents

由圖1A可知，在培養(yǎng)基pH=2.0的條件下，菌株FJ-J-3在不含Na2SO4的對照組培養(yǎng)基中生物量最大，OD600nm值達(dá)到4.87；隨著Na2SO4含量的增加細(xì)胞生長越慢，在含有6%Na2SO4的鹽培養(yǎng)基中，菌株FJ-J-3的生長嚴(yán)重受到抑制，最大OD600nm值=2.3。由圖1B可知，在培養(yǎng)基pH=2.0的條件下，Na2SO4含量會影響菌株FJ-J-3發(fā)酵產(chǎn)乙醇，Na2SO4含量越高，乙醇產(chǎn)量越低。即當(dāng)Na2SO4含量為0、2%、4%、6%時，菌株FJ-J-3培養(yǎng)到60 h時乙醇產(chǎn)量分別為1.3%vol、1.1%vol、0.79%vol、和0.4%vol。由此可見，菌株FJ-J-3在pH=2.0的培養(yǎng)基中Na2SO4鹽耐受較弱。

2.2 pH為4.0條件下不同鹽含量對菌株FJ-J-3的影響

當(dāng)培養(yǎng)基pH=4.0時，東方伊薩酵母FJ-J-3在不同的鹽含量培養(yǎng)基中的生長狀況及乙醇含量結(jié)果見圖2。

圖2 菌株FJ-J-3在pH為4.0的不同Na2SO4含量培養(yǎng)基中的生長曲線（A）及乙醇含量（B）Fig.2 Growth curve(A)and ethanol content(B)of strain FJ-J-3 in medium with pH 4.0 and different Na2SO4 contents

由圖2A可知，菌株FJ-J-3在培養(yǎng)基pH=4.0的條件下，當(dāng)Na2SO4含量為2%時，菌株FJ-J-3的OD600nm值最大，且最大OD600nm值為26.5；對照培養(yǎng)基中菌株FJ-J-3的最大OD600nm值為24.1；當(dāng)Na2SO4含量為4%、6%時，菌株FJ-J-3的最大OD600nm值分別為23.2、21.3。由此得出，菌株FJ-J-3在偏酸（pH=4.0）的環(huán)境中生長良好，且在這種環(huán)境中，菌株對鹽的耐受性增加，即使在6%鹽含量的情況下菌株仍能旺盛生長，說明一定的酸可以增加菌株對鹽的脅迫的耐受性。

由圖2B可知，菌株FJ-J-3在培養(yǎng)基pH=4.0的條件下，當(dāng)培養(yǎng)基中Na2SO4含量為2%時，菌株FJ-J-3的乙醇產(chǎn)量最大，在發(fā)酵36 h時乙醇產(chǎn)量達(dá)到最大（2.99%vol），而對照組、Na2SO4含量分別為4%、6%的條件下乙醇產(chǎn)量則分別為2.54%vol、2.27%vol、2.02%vol。由此得出，在偏酸（pH=4.0）的環(huán)境中少量的鹽可以促進菌株發(fā)酵產(chǎn)乙醇，而高濃度的鹽對菌株的乙醇發(fā)酵有一定的影響。

2.3 pH為6.0條件下不同鹽含量對菌株FJ-J-3的影響

當(dāng)培養(yǎng)基pH=6.0時，東方伊薩酵母FJ-J-3在不同的鹽含量培養(yǎng)基中的生長狀況及乙醇含量結(jié)果見圖3。

由圖3A可知，當(dāng)培養(yǎng)基pH=6.0時，菌株FJ-J-3的生長狀況受鹽濃度影響較小。當(dāng)Na2SO4含量為6%時，菌株FJ-J-3生長最好，最大OD600nm值為27.5；對照組的最大OD600nm值為24.3；當(dāng)Na2SO4含量為2%、4%時，菌株FJ-J-3的最大OD600nm值分別為22.6、21.2。因菌株FJ-J-3的最佳生長pH為6.0，因此在這種環(huán)境中菌株的生長受鹽脅迫的影響較小，這種最佳的pH使得菌株能夠耐受較高的Na2SO4含量。

由圖3B可知，在pH=6.0的培養(yǎng)基中，當(dāng)Na2SO4含量為6%時，菌株FJ-J-3的乙醇產(chǎn)量也最高，達(dá)到2.93%vol；對照組中菌株FJ-J-3的最高乙醇產(chǎn)量達(dá)到2.55%vol；當(dāng)Na2SO4含量為2%、4%時，菌株FJ-J-3的最高乙醇產(chǎn)量分別為1.97%vol、1.76%vol。說明在pH=6.0的條件下，菌株FJ-J-3對Na2SO4的耐受性增加。

圖3 菌株FJ-J-3在pH為6.0的不同Na2SO4含量培養(yǎng)基中的生長曲線（A）及乙醇含量（B）Fig.3 Growth curve(A)and ethanol content(B)of strain FJ-J-3 in medium with pH 6.0 and different Na2SO4 contents

2.4 pH為8.0條件下不同鹽含量對菌株FJ-J-3的影響

當(dāng)培養(yǎng)基pH=8.0時，東方伊薩酵母FJ-J-3在不同的鹽含量培養(yǎng)基中的生長狀況及乙醇含量結(jié)果見圖4。

由圖4A可知，當(dāng)培養(yǎng)基pH=8.0時，菌株FJ-J-3的生長受到一定的影響，在前12 h菌株生長緩慢，分析原因可能是由于培養(yǎng)基的堿性，導(dǎo)致菌株不能很快進入生長階段，需要一段時間的適應(yīng)和調(diào)整。12 h以后菌株逐漸適應(yīng)環(huán)境，進入生長期，然而菌株的生長量與pH=4.0和pH=6.0環(huán)境的生長量仍然有所不同。當(dāng)Na2SO4含量為2%時，菌株FJ-J-3的OD600nm值最大，為20.9；其次為對照（OD600nm為18.6）。當(dāng)Na2SO4含量為4%和6%時，菌株FJ-J-3的最大OD600nm值分別為17.9和15.4。由此可見，在6%鹽濃度培養(yǎng)基中菌體的生長受影響較大。這說明偏堿的環(huán)境菌株對鹽的耐受性減弱。

由圖4B可知，由于菌體生長受到影響，所以在培養(yǎng)基pH=8.0時，菌株FJ-J-3在不同鹽濃度培養(yǎng)基中的乙醇產(chǎn)量也受到影響。菌株FJ-J-3在Na2SO4含量為2%的培養(yǎng)基中乙醇產(chǎn)量高于其他3組，乙醇產(chǎn)量最高達(dá)到2.34%vol。由此得出，在偏酸或偏堿的環(huán)境中，少量的鹽可以提高菌株發(fā)酵產(chǎn)乙醇的能力。

圖4 菌株FJ-J-3在pH為8.0的不同Na2SO4含量培養(yǎng)基中的生長曲線（A）及乙醇含量（B）Fig.4 Growth curve(A)and ethanol content(B)of strain FJ-J-3 in medium with pH=8.0 and different Na2SO4 contents

3 結(jié)論

該研究對東方伊薩酵母（Issatchenkia orientalis）FJ-J-3的pH、鹽耐受性進行了研究。結(jié)果表明，東方伊薩酵母FJ-J-3對環(huán)境脅迫有一定的耐受性，當(dāng)pH為2.0、不含Na2SO4時，OD600nm值（4.8）和乙醇產(chǎn)量（1.3%vol）最高；當(dāng)pH為4.0、Na2SO4含量為2%時，OD600nm值（26.5）和乙醇產(chǎn)量（3.0%vol）最高；當(dāng)pH為6.0、Na2SO4含量為6%時，OD600nm值（27.5）和乙醇產(chǎn)量（2.9%vol）最高；當(dāng)pH為8.0、Na2SO4含量為2%時，OD600nm值（20.9）和乙醇產(chǎn)量（2.3%vol）最高。在pH=4.0和pH=6.0培養(yǎng)條件下具有較好的鹽耐受性，在pH=2.0和pH=8.0的條件下，菌株FJ-J-3對鹽的耐受性減弱。本研究為菌株發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的進一步開發(fā)利用提供理論依據(jù)。