王云鵬，鄭文武，夏夢(mèng)△，程玲，廖雙華，李丹，陳雨露，李亞菲

一氧化氮（NO）是心血管系統(tǒng)中的關(guān)鍵信號(hào)傳導(dǎo)分子，具有控制炎癥、調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激等眾多功能［10］。NO生物利用度的改變已被視為內(nèi)皮損傷和動(dòng)脈粥樣硬化的關(guān)鍵原因之一，而且可能與脂質(zhì)過氧化，氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)等有關(guān)［11］。那么，嗜酸乳桿菌通過抑制炎癥和氧化應(yīng)激發(fā)揮抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用是否與調(diào)節(jié)NO生物利用度、改善內(nèi)皮功能有關(guān)？本研究擬通過觀察嗜酸乳桿菌對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化模型大鼠NO及其相關(guān)氧化介質(zhì)的影響，探討其在預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展中的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 6周齡SPF級(jí)雄性大鼠24只，體質(zhì)量140～160 g，購自西南醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心；嗜酸乳桿菌ATCC4356購自廣東省微生物菌種保藏中心；MRS瓊脂培養(yǎng)基、MRS肉湯培養(yǎng)基、卵清白蛋白、牛血清蛋白均購自北京索萊寶科技有限公司；YQX-Ⅱ厭氧培養(yǎng)箱購自青島明博環(huán)?？萍加邢薰?；Trizol試劑購自美國Invitrogen?公司；SYBR?Premix Ex Taq?試劑盒購自日本TaKaRa公司；StepOne?Real-time PCR儀、BCA蛋白質(zhì)濃度測(cè)定試劑盒購自美國Life technologies公司；NO 檢測(cè)試劑盒、3-NT（3-Nitrotyrosine）ELISA檢測(cè)試劑盒、氧化低密度脂蛋白（oxLDL）ELISA檢測(cè)試劑盒、精氨酸酶（ARG）檢測(cè)試劑盒、總氨基酸檢測(cè)試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；維生素D3注射液購自上海通用藥業(yè)股份有限公司。高脂飼料配方：3%膽固醇+0.5%膽酸鈉+0.2%丙基硫氧嘧啶+10%豬油+5%白糖+81.3%基礎(chǔ)飼料?；A(chǔ)飼料來自于西南醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心；膽固醇、膽酸鈉及丙基硫氧嘧啶購自上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司。

1.2 方法

1.2.1 灌胃液的制備 嗜酸乳桿菌復(fù)蘇后三區(qū)劃線接種于MRS瓊脂培養(yǎng)基上，常規(guī)培養(yǎng)2代后，挑取單菌落在MRS肉湯培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，之后按2%接種量接種于MRS肉湯培養(yǎng)基，再培養(yǎng)24 h，傳3代后即為實(shí)驗(yàn)菌株。4℃，6 000 r/min離心10 min，離心后的菌體用無菌PBS洗滌3次，再將菌體重懸于PBS，并用比濁法制備成1×109CFU/mL菌液［8］。

1.2.2 動(dòng)物分組及模型建立 所有大鼠隨機(jī)分成3組：正常飲食組、高脂飲食組和嗜酸乳桿菌組，每組8只。普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，正常飲食組大鼠繼續(xù)普通飼料喂養(yǎng)，高脂飲食組大鼠開始復(fù)合法喂養(yǎng)：高脂飼料+腹腔注射維生素D3+免疫損傷法+FeSO4［12］。嗜酸乳桿菌組大鼠在高脂飲食組復(fù)合喂養(yǎng)的同時(shí)，每天灌胃0.5 mL制備好的嗜酸乳桿菌菌液（其余2組每天灌胃相同體積的無菌生理鹽水）。每組大鼠每日在相同環(huán)境下自由進(jìn)食，3組大鼠共飼養(yǎng)12周，每周稱大鼠體質(zhì)量，直至取材。

1.2.3 氧化和炎癥介質(zhì)及精氨酸、精氨酸酶水平檢測(cè) 第12周末，所有大鼠經(jīng)腹主動(dòng)脈采血，分離血清，按照ELISA試劑盒說明書，檢測(cè)血清oxLDL、過氧亞硝基（ONOO-）、精氨酸酶含量。硝酸還原法檢測(cè)NO含量，比色法測(cè)定血清精氨酸含量。

1.2.4 HE染色觀察主動(dòng)脈形態(tài)學(xué)變化 大鼠采血后處死，取主動(dòng)脈弓，4%多聚甲醛固定，常規(guī)脫水、浸蠟、包埋，制成5μm切片，行HE染色后依次用無水乙醇和二甲苯脫水，中性樹膠封片后于顯微鏡下觀察形態(tài)學(xué)變化。

1.2.5 Real-time PCR檢測(cè)主動(dòng)脈eNOS、iNOS mRNA的表達(dá) 于-80℃冰箱取主動(dòng)脈組織100 mg，TRIzol法提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系包含引物工作液（2.5μmol/L）1.0μL、2×qPCR Mix 5.0μL、上下游引物各0.5μL、ddH2O 2.8μL、Rox 0.2μL。內(nèi)參GAPDH引物：上游5′-CGCTAACATCAAATGGGGTG-3′，下 游 5′-TTGCTGACAATCTTGAGGGAG-3′。iNOS 引物：上游 5′-AGCATCCACGCCAAGAACG-3′，下 游 5′-GTCTGGTTGCCTGGGAAAAT-3′。eNOS 引 物：上游 5′-CCTACAGAGCAGCAAATCCAC-3′，下 游 5′-GAAGTGATGTCCAGGAAGTAAGTG-3′。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性1 min；95 ℃ 15 s，58 ℃ 20 s，72 ℃ 45 s，40個(gè)循環(huán)。最后采用2－ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量，其中 ΔCt=Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因，ΔΔCt=ΔCt實(shí)驗(yàn)組-ΔCt對(duì)照組。

“鳧脛雖短，續(xù)之則憂；鶴脛雖長，斷之則悲”，這是常識(shí)?？伞皵帔Q續(xù)鳧”“絡(luò)馬穿牛”、強(qiáng)求一致的教育卻戕害了孩子的天性，徒勞無益還算是小事，更重要的是，它剝奪了孩子快樂的權(quán)利，澆滅了他們天賦的火花。

1.2.7 Western blot分析NF-κB p65亞基的表達(dá) Trizol法提取主動(dòng)脈細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和核蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度。每孔加載蛋白質(zhì)約50μg行SDS-PAGE電泳（80 V 30 min后120 V電泳1 h）。電泳后再將蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上（濕轉(zhuǎn)）。然后在5%脫脂牛奶中將膜封閉2 h，添加GAPDH（1∶10 000），Histone H3（1∶3 000），NF-κB p65（1∶2 000）一抗于4℃孵育過夜。次日用含有0.1%Tween-20的TBS洗滌3次后，將膜與抗小鼠IgG二抗于室溫下孵育0.5 h。再在搖床上洗滌4次，每次5 min，最后使用ECL發(fā)光試劑盒檢測(cè)蛋白表達(dá)情況。GAPDH作為細(xì)胞質(zhì)蛋白內(nèi)參，Histone-H3作為核蛋白內(nèi)參。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，2組比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組比較用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t法。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3組大鼠體質(zhì)量的變化 整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中，高脂飲食組和嗜酸乳桿菌組大鼠體質(zhì)量變化差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但較正常飲食組大鼠均有明顯增長（P＜0.01）。見表1。

Tab.1 Changes of body weights of the three groups of rats in different time points表1 3組大鼠各時(shí)期體質(zhì)量的變化 （n=8，g，±s）

Tab.1 Changes of body weights of the three groups of rats in different time points表1 3組大鼠各時(shí)期體質(zhì)量的變化 （n=8，g，±s）

＊＊P＜0.01；a與正常飲食組比較，b與高脂飲食組比較，P＜0.05

組別正常飲食組高脂飲食組嗜酸乳桿菌組F第4周末195.91±9.60 249.82±10.07a 246.94±14.00a 56.64＊＊第8周末258.09±12.99 367.59±13.82a 358.05±14.63a 153.89＊＊第12周末303.78±11.97 457.15±13.20a 448.91±12.81a 370.84＊＊

2.2 3組大鼠動(dòng)脈粥樣硬化病變 HE染色結(jié)果顯示，正常飲食組大鼠的主動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞完整，平滑肌纖維正常且排列緊密，沒有發(fā)現(xiàn)動(dòng)脈粥樣硬化改變（圖1A）。相反，高脂飲食組大鼠主動(dòng)脈形成廣泛的動(dòng)脈粥樣硬化病變，表現(xiàn)為膠原纖維明顯增多，排列紊亂，局灶可見平滑肌細(xì)胞核固縮、壞死，內(nèi)皮細(xì)胞大部分脫落，且可見泡沫細(xì)胞（圖1B）。與高脂飲食相比，嗜酸乳桿菌組大鼠的主動(dòng)脈形態(tài)得到明顯改善，僅內(nèi)皮細(xì)胞增生，略有變形、排列紊亂，沒有觀察到壞死的平滑肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞脫落和泡沫細(xì)胞（圖1C）。

Fig.1 Morphological changes of aortic endothelial cells in different feeding groups圖1 不同喂養(yǎng)組主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化

2.3 3組大鼠血清學(xué)指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果 與正常飲食組相比，高脂飲食組大鼠血清oxLDL、精氨酸酶和ONOO-水平升高，NO、精氨酸水平下降（P＜0.01）；而與高脂飲食組相比，嗜酸乳桿菌組大鼠血清oxLDL、ONOO-和精氨酸酶水平明顯降低（P＜0.01），血清NO及精氨酸含量顯著升高（P＜0.01）。見表2。

Tab.2 Test results of serum biochemical indicators in three groups of rats表2 3組大鼠血清生化指標(biāo)的檢測(cè)結(jié)果 （n=8，±s）

Tab.2 Test results of serum biochemical indicators in three groups of rats表2 3組大鼠血清生化指標(biāo)的檢測(cè)結(jié)果 （n=8，±s）

＊＊P＜0.01；a與正常飲食組比較，b與高脂飲食組比較，P＜0.05

NO（mmol/L）27.49±3.28 14.24±1.68a 18.11±2.09b 61.94＊＊組別正常飲食組高脂飲食組嗜酸乳桿菌組F oxLDL（ng/L）2 456.36±185.39 8 132.02±466.78a 3 348.04±67.18b 870.74＊＊精氨酸（mmol/L）7.82±1.18 4.23±1.40a 6.36±1.64b 12.92＊＊精氨酸酶（μg/L）3 724.52±332.89 8 993.90±200.61a 5 068.68±151.76b 1 033.47＊＊ONOO-（μg/L）1.64±0.10 9.09±0.50a 5.5±0.80b 370.28＊＊

2.4 3組大鼠主動(dòng)脈eNOS和iNOS mRNA表達(dá)變化 Real-time PCR結(jié)果顯示，高脂飲食組大鼠中主動(dòng)脈組織iNOS mRNA表達(dá)水平較正常飲食組升高，eNOS mRNA表達(dá)水平則減低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；而與高脂飲食組相比，嗜酸乳桿菌組大鼠主動(dòng)脈iNOS mRNA水平降低，eNOS mRNA表達(dá)升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見表3。

2.5 3組大鼠主動(dòng)脈組織NF-κB p65表達(dá)結(jié)果 與正常飲食組相比，高脂飲食組大鼠NF-κB p65亞基在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)下調(diào)，而胞核中p65亞基表達(dá)顯著升高（P＜0.01），提示高脂飲食的喂養(yǎng)會(huì)使NF-κB p65從細(xì)胞質(zhì)大量轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核，激活NF-κB通道。而嗜酸乳桿菌則明顯抑制了p65亞基從細(xì)胞質(zhì)到核的轉(zhuǎn)移，與高脂飲食組相比，NF-κB p65亞基在細(xì)胞質(zhì)的表達(dá)升高，而胞核中p65亞基表達(dá)顯著下降（P＜0.01）。見圖2、表4。

Tab.3 Changes of the expressions of eNOS and eNOS mRNA in rat aorta of three groups表33組大鼠主動(dòng)脈eNOS和iNOS mRNA表達(dá)變化（n=8，±s）

Tab.3 Changes of the expressions of eNOS and eNOS mRNA in rat aorta of three groups表33組大鼠主動(dòng)脈eNOS和iNOS mRNA表達(dá)變化（n=8，±s）

＊＊P＜0.01；a與正常飲食組比較，b與高脂飲食組比較，P＜0.05

組別正常飲食組高脂飲食組嗜酸乳桿菌組F iNOS 0.97±0.14 2.58±0.29a 0.37±0.08ab 278.29＊＊eNOS 0.98±0.12 0.43±0.12a 1.98±0.16ab 274.19＊＊

Fig.2 Effects of lacidophilus administration on the aortic protein levels of NF-κB p65圖2 嗜酸乳桿菌對(duì)主動(dòng)脈NF-κB p65蛋白水平的影響

Tab.4 Changes of aortic protein levels of NF-κB p65 in three groups of rats表4 3組大鼠主動(dòng)脈組織NF-κB p65蛋白表達(dá)變化（n=8，±s）

Tab.4 Changes of aortic protein levels of NF-κB p65 in three groups of rats表4 3組大鼠主動(dòng)脈組織NF-κB p65蛋白表達(dá)變化（n=8，±s）

＊＊P＜0.01；a與正常飲食組比較，b與高脂飲食組比較，P＜0.05

組別正常飲食組高脂飲食組嗜酸乳桿菌組F NF-κB p65（細(xì)胞質(zhì)）0.54±0.06 0.16±0.03a 0.35±0.05b 114.01＊＊NF-κB p65（細(xì)胞核）0.12±0.02 0.65±0.07a 0.33±0.04b 250.31＊＊

3 討論

目前認(rèn)為，內(nèi)皮功能障礙、炎性介質(zhì)的釋放和脂質(zhì)過氧化在動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)展和易損斑塊的形成中發(fā)揮關(guān)鍵作用［13］。而NO作為心血管系統(tǒng)中的關(guān)鍵信號(hào)傳導(dǎo)分子，在調(diào)節(jié)氧化炎癥反應(yīng)、保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞等多種方面發(fā)揮著重要作用，其生物利用度的改變是導(dǎo)致內(nèi)皮損傷和動(dòng)脈粥樣硬化的關(guān)鍵原因之一。

一氧化氮合酶（NOS）是精氨酸合成NO的唯一限速酶，其有3種亞型：內(nèi)皮型NOS（eNOS）、神經(jīng)型NOS（nNOS）和誘導(dǎo)型 NOS（iNOS）［14］。Hare等［15］研究發(fā)現(xiàn)由eNOS衍生的NO可以通過抑制LDL氧化、抑制血管平滑肌細(xì)胞的增殖等多種途徑發(fā)揮抗動(dòng)脈粥樣硬化作用。而更深入研究發(fā)現(xiàn)，eNOS發(fā)揮這種催化作用前必須與其底物精氨酸和輔因子四氫生物蝶呤（BH4）結(jié)合，形成二聚體，這種偶聯(lián)效應(yīng)對(duì)于NO的產(chǎn)生來說，比eNOS蛋白本身的實(shí)際存在更重要［16］。未與其輔因子或底物偶聯(lián)的eNOS單體反而會(huì)變成超氧化物產(chǎn)生酶，使超氧陰離子（O2-）產(chǎn)生增加，NO水平降低，這種現(xiàn)象稱為eNOS的解偶聯(lián)［17］。而Bartnicki等［18］證明精氨酸的缺乏恰好會(huì)促進(jìn)NOS解偶聯(lián)和內(nèi)皮功能障礙。另一方面，多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)炎癥發(fā)生時(shí)，增加的oxLDL上調(diào)小窩蛋白，并激活精氨酸酶（Arg）的表達(dá)，Arg催化精氨酸轉(zhuǎn)化為鳥氨酸和尿素，導(dǎo)致eNOS的解偶聯(lián)，減少NO的產(chǎn)生，從而誘發(fā)血管功能障礙和損害［19-20］。所以，精氨酸和Arg的表達(dá)水平是NOS偶聯(lián)與解偶聯(lián)的關(guān)鍵因素，直接影響到內(nèi)皮細(xì)胞NO的產(chǎn)生。

本實(shí)驗(yàn)通過觀察不同喂養(yǎng)情況下大鼠oxLDL、NO、eNOS、精氨酸、Arg的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)高脂飲食大鼠血清oxLDL、Arg明顯升高，導(dǎo)致精氨酸含量顯著降低，使eNOS發(fā)生解偶聯(lián)，從而抑制NO合成，促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)展。而嗜酸乳桿菌的喂養(yǎng)降低了高脂大鼠血清oxLDL、Arg的含量，使血清精氨酸含量升高，抑制了eNOS發(fā)生解偶聯(lián)效應(yīng)，并增加了eNOS表達(dá)，促進(jìn)了NO的合成，增加了其保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞的作用。本實(shí)驗(yàn)通過觀察不同時(shí)期3組大鼠的體質(zhì)量變化，發(fā)現(xiàn)嗜酸乳桿菌的喂養(yǎng)并沒有對(duì)大鼠的體質(zhì)量帶來明顯的改變，這與既往的幾項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本一致。

iNOS在生理?xiàng)l件下通常不存在于脈管系統(tǒng)中，其表達(dá)被炎癥、氧化應(yīng)激等病理狀況所誘導(dǎo)［21］。當(dāng)炎癥發(fā)生時(shí)，iNOS在活化的單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中過度表達(dá)，一方面與eNOS競爭底物，使eNOS發(fā)生解偶聯(lián)，降低NO的產(chǎn)生［22］；另一方面與鈣調(diào)蛋白結(jié)合，產(chǎn)生大量的O2-，與周圍的NO自發(fā)反應(yīng)形成ONOO-［23］。ONOO-是一種強(qiáng)氧化因子，具有高反應(yīng)性和細(xì)胞毒性，能氧化LDL，在促進(jìn)oxLDL的聚集、泡沫細(xì)胞形成、內(nèi)皮細(xì)胞損傷等方面發(fā)揮重要作用［24］。而且，過度產(chǎn)生的iNOS和ONOO-都能激活經(jīng)典的NF-κB通道［25-26］，誘導(dǎo)產(chǎn)生更多的細(xì)胞因子和其他急性期反應(yīng)物進(jìn)一步放大炎癥反應(yīng)和損傷內(nèi)皮功能［27］。在生理狀態(tài)之下，由于NF-κB與抑制性IκB（NF-κB的抑制劑）的結(jié)合，NF-κB被無活性地保留在細(xì)胞質(zhì)中。只有在炎癥等病理情況下，磷酸化的IκB被蛋白酶體降解，釋放出來的NF-κB p50和p56亞基轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核并結(jié)合靶基因中的NF-κB基序，引起血管病變的發(fā)生［28］。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)高脂飲食大鼠主動(dòng)脈iNOS表達(dá)和血清ONOO-含量較正常飲食組明顯升高，NF-κB p56亞基從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核；高水平的iNOS一方面使eNOS發(fā)生解偶聯(lián)，降低NO的產(chǎn)生；另一方面促使ONOO-、oxLDL的大量生成，激活經(jīng)典的NF-κB通道，進(jìn)一步加重炎癥反應(yīng)。而嗜酸乳桿菌恰好能通過抑制iNOS的表達(dá)，減少eNOS解偶聯(lián)，降低ONOO-的產(chǎn)生，抑制NF-κB通道的激活，從而抑制炎癥瀑布反應(yīng)和內(nèi)皮損傷。

綜上所述，嗜酸乳桿菌一方面可以通過抑制Arg，減少精氨酸分解，抑制eNOS發(fā)生解偶聯(lián)，促進(jìn)eNOS的表達(dá)和NO的合成；另一方面可以通過降低iNOS的表達(dá)，減少ONOO-的生成，抑制NF-κB通道的激活所誘發(fā)的氧化應(yīng)激瀑布反應(yīng)，達(dá)到改善NO生物利用度、抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)的作用，從而減輕動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)展。本文為嗜酸乳桿菌抑制動(dòng)脈粥樣硬化的形成提出了新思路，可能對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化的綜合預(yù)防甚至治療產(chǎn)生一定影響。