程智超，欒雨陽，康浩洋，王文浩，吳昊旻

（1.黑龍江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150000；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，哈爾濱 150030；3.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部甜菜品質(zhì)監(jiān)督檢驗測試中心，黑龍江大學(xué)農(nóng)作物研究院，哈爾濱 150000）

水是生命之源，20 世紀(jì)70 年代以來，人口迅速增加，城市化工業(yè)化發(fā)展日益加快，水資源短缺已經(jīng)威脅到了糧食生產(chǎn)，隨意排放養(yǎng)殖廢水一方面增加水污染，另一方面損害周邊居民的生活與健康，在這項研究中，我們調(diào)查了土壤細(xì)菌群落的組成與豬場養(yǎng)殖廢水的關(guān)系。研究地點位于中國東北的三江平原，試驗地種植水稻，用已處理的養(yǎng)殖廢水與未處理的養(yǎng)殖廢水和清水進(jìn)行澆灌。細(xì)菌特異性16S rRNA 內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)的高通量測序用于鑒定細(xì)菌分類群。在所有三種樣品類型中，細(xì)菌多樣性在已處理的未處理的養(yǎng)殖廢水用中最高，在清水中較低，經(jīng)過處理的養(yǎng)殖廢水最低。這些發(fā)現(xiàn)強(qiáng)調(diào)了有效管理土壤細(xì)菌群落以維持自然功能土壤生態(tài)系統(tǒng)的重要性，提出適宜的養(yǎng)殖廢水灌溉方法.。

養(yǎng)殖廢水被我國充分發(fā)揮其“水肥效應(yīng)”優(yōu)勢，深刻感受到養(yǎng)殖廢水對我國的重要影響，取得了非常大的利益。但是，養(yǎng)殖廢水規(guī)模的進(jìn)一步擴(kuò)大，環(huán)境也隨之出現(xiàn)了問題，土壤由于鈉害的退化;有毒元素對作物的毒害與污染等。由此可見，養(yǎng)殖廢水灌溉對農(nóng)作物生長、以及對農(nóng)田環(huán)境的污染等方面都存在著諸多的不定因素。

基于高通量DNA 測序技術(shù)，在此評估土壤細(xì)菌群落的多樣性，實驗研究對揭示養(yǎng)殖廢水灌溉土壤環(huán)境的影響有重要幫助。該研究有助于改善土壤生態(tài)系統(tǒng)，對農(nóng)民保護(hù)和利用農(nóng)田提供明確指導(dǎo)。

1 場地描述與土壤采樣

該研究在黑龍江省科學(xué)院自然與生態(tài)研究所三江濕地實驗站（北緯47°35'，東經(jīng)133°31'）進(jìn)行。當(dāng)?shù)卦缕骄鶜鉁卦?月為-21.6 ℃至7月為21.5 ℃，年平均氣溫為1.9 ℃。海拔55～65 m，年平均降水量為550～610 mm，其中約80%發(fā)生在5～10月。

根據(jù)試驗地的土層厚度特征，利用用剖面取樣法，于2018 年10 月15 日在0～20 cm 的深度采集土壤樣本，每塊地選取有代表性的5個點取土樣。在每個地點取樣約1 500 g 。把每份新鮮的土樣用連個袋子裝，一個袋子的新鮮土樣用來自然風(fēng)干，風(fēng)干后，磨成粉，檢查密封性后,裝好放于4C冷卻，立即送回實驗室，并及時進(jìn)行試驗檢測。

2 土壤微生物DNA的提取

利用FastDNA0 SpinKitforSoil試劑盒MPBiomedicals提取0.5 g 三組土壤細(xì)菌基因組總DNA，將每組提取得到的土壤DNA 溶解在70 μL 無菌TE 緩沖液40 mmol·L-1TrisHCl，1 mmol·L-1EDTA，pH 8.0）詳細(xì)按說明書進(jìn)行操作。

高通量測序：細(xì)菌基因組總DNA 送到上海Majorbio 生物技術(shù)有限公司進(jìn)行Miseq高通量測序。細(xì)菌16srDNA擴(kuò)增引物采用通用引物（8F/533R）。

3 基因優(yōu)化

可以正向或反向地影響到基因的表達(dá)，內(nèi)含子供體和接入位點的共同識別序列分別是CAG，GUA。在前一個接入位點上的外顯子下游也有一個富含GAG 的區(qū)域。外顯子中剪接增強(qiáng)子的存在能極大地促進(jìn)內(nèi)含子的切除和成熟mRNA 向細(xì)胞質(zhì)的外送。在載體設(shè)計中,在eDN&前至少加入1個內(nèi)含子會促進(jìn)cDNA 的表達(dá)。而為了切除內(nèi)含子，則需要在第一個和最后一個外顯子中包含剪接增強(qiáng)子序列有助于精確控制外源基因編碼序列的高表達(dá)。

OTU 群落聚類及相關(guān)分析：按每個小組為一個OUT 的原則，通過歸類操作，將序列按照DNA 相似性分為許多個小組。通常按97%（0.03）的有序列進(jìn)行OTU 劃分并進(jìn)行生物信息統(tǒng)計分析。

構(gòu)建稀疏曲線：利用已測得16S rDNA 序列中已知的各種OTU 的相對比例，來計算抽取n個（n小于測得reads 序列總數(shù)）reads時出現(xiàn)OTU數(shù)量的期望值。

PCoA 分析：通過一系列的特征值進(jìn)行排序后，選擇主要排在前幾位的特征值，利用PCoA 可以找到距離矩陣中最主要的坐標(biāo)，并且不改變樣品點之間的相互位置關(guān)系，只改變了坐標(biāo)系統(tǒng)。通過PCoA 分析可以用來觀察每個個體與群落之間的關(guān)系。

4 小 結(jié)

從3 種灌溉用水對土壤微生物細(xì)菌群落的影響來看，對農(nóng)田的耕種及利用方式具有重要作用。土壤微生物細(xì)菌多樣性可以表示上壤生態(tài)系統(tǒng)的變化。用未處理養(yǎng)殖廢水灌溉與用清水灌溉和已處理養(yǎng)殖廢水灌溉相比較，用未處理養(yǎng)殖發(fā)水灌溉后，土壤微生物群落得到一定改善，土壤養(yǎng)分升高，改善了土壤微生物學(xué)性質(zhì)。本研究意在通過灌溉養(yǎng)豬養(yǎng)殖廢水種植農(nóng)作物，測試土壤微生物細(xì)菌群落的組成，探討該養(yǎng)殖廢水用于農(nóng)作物裁培的可能性,為養(yǎng)殖廢水灌溉方法提供適宜的方法。